地衣芽孢杆菌与3种微藻生长的相互影响 - 水产前沿网 | 网聚全球水产华人

摘要：为弄清水产养殖中常用的有益菌——地衣芽孢杆菌和3 种常见的浮游微藻的相互关系，本文采用陈海水配制的无机培养液和对虾养殖池水，分别研究了地衣芽孢杆菌对微绿球藻、隐藻和颤藻的影响以及这几种微藻对地衣芽孢杆菌的反作用。以通径分析法分析微绿球藻、隐藻和地衣芽孢杆菌对颤藻直接和间接影响力的大小。结果发现，地衣芽孢杆菌对微绿球藻有一定的抑制作用，对隐藻的促进作用明显，而对颤藻的作用效果不明显；在与微绿球藻和隐藻混合培养时，地衣芽孢杆菌生长正常，仅在藻细胞密度较大时受到一定程度的抑制；在与颤藻混合培养时，地衣芽孢杆菌受到明显的抑制作用。通径分析结果发现，地衣芽孢杆菌与微绿球藻协同对颤藻产生抑制作用，而隐藻对颤藻的作用较弱。

微藻是水域生态系统中的生产者之一，在水产养殖环境中起增加溶氧、降解氮磷等营养盐和为早期的水产动物提供优质饵料等重要作用。而细菌是重要的分解者，能够降解有机物，在物质和能量循环中的作用举足轻重。据研究，某些异养细菌能够快速分解藻类所分泌的有机物及死亡的藻细胞，并将其转化成小分子物质供微藻利用[1-5]，有的细菌甚至能够分泌维生素B12 等物质，与藻类形成共生关系[6]。目前微生态制剂在水产养殖中已得到广泛应用，一些有益菌对水生态调控具有明显的效果[7-10]，但这些有益菌对水中另一类重要的微生物——微藻的影响及有益菌在水中的变化规律则少有研究。本文以较常用的有益菌———地衣芽孢杆菌和对虾养殖池中几种优势微藻为研究对象，研究地衣芽孢杆菌与微藻的相互作用，为在养殖生产中更好地使用有益菌提供理论依据。据Lathrop[11]研究，增加无机氮以改变氮磷比不能使水体免于发生水华，较低的氮磷比只是水华发生的前兆而不是原因，磷的浓度过高才是真正原因，所以要抑制蓝藻的爆发应该从其他思路考虑。本实验也验证是否能够通过有益菌和微藻协同作用来抑制颤藻的生长。

将藻液以10 000 r·min-1 离心5 min，去掉上清液；重复洗涤，离心1 次，去除原培养液中的营养；接入500 mL 锥形瓶中，使各种微藻的初始密度均为7×104 cells·mL-1。地衣芽孢杆菌液以8 000 r·min-1 离心10 min，去掉上清液；重复洗涤，离心1 次，接入500 mL 锥形瓶中，使地衣芽孢杆菌细胞密度达到5×104 CFU·mL-1。

无机培养液中各组微藻生长情况如图1~3 所示。在微绿球藻和地衣芽孢杆菌混合培养组中，培养初期地衣芽孢杆菌对微绿球藻具有促进作用，培养的前2d 菌藻混合组微绿球藻平均生长速率为0.47，明显大于单培养组的0.40，但从第4 d 开始，地衣芽孢杆菌对微绿球藻起抑制作用，单培养组微绿球藻的生长速率大于加菌组，第6~16 d 两组微绿球藻的生物量差异显著（P＜0.05）。在隐藻和地衣芽孢杆菌混合培养组中，地衣芽孢杆菌对隐藻的生长起明显促进作用，第6~14 d 菌藻混合组隐藻生物量显著高于单培养组（P＜0.05）。在颤藻和地衣芽孢杆菌混合培养组中，地衣芽孢杆菌对颤藻生物量的影响很小，各取样节点菌藻混合组和颤藻单培养组的差异均不显著。

对虾养殖池水培养液中各组微藻生长情况如图4~6 所示。在微绿球藻和地衣芽孢杆菌混合培养组中，培养初期地衣芽孢杆菌对微绿球藻起促进作用，培养的前2 d 菌藻混合组微绿球藻生长速率0.56 远大于单培养组的0.27，但从第4 d 开始，地衣芽孢杆菌对微绿球藻起抑制作用，第4~16 d 菌藻混合组微绿球藻生物量小于单培养组，差异显著（P＜0.05），且菌藻混合组微绿球藻的平均生长速率0.27 小于单培养组的0.30。在隐藻和地衣芽孢杆菌混合培养组中，地衣芽孢杆菌对隐藻的促进作用更加明显，菌藻混合组隐藻的平均生长速率0.25 大于单培养的0.20，第4~16 d 菌藻混合组和单培养组的隐藻生物量差异显著（P＜0.05），最大生物量分别为392×104 cell·mL-1 和182.3×104 cell·mL-1。在颤藻和地衣芽孢杆菌混合培养组中，地衣芽孢杆菌对颤藻的影响不大，只有第6 d 时菌藻混合组的颤藻生物量显著大于单培养组（P＜0.05）。

无机培养液中地衣芽孢杆菌生物量变化如图7所示。实验周期中地衣芽孢杆菌单培养的生物量远高于菌藻混合培养组，最高生物量为11.8×104 CFU·mL-1；地衣芽孢杆菌与微绿球藻混合培养组中，菌和藻生物量的相关系数r=-0.699，P=0.054 （在α=0.05 水平下线性关系不显著），在第6~8 d 微绿球藻达到较高生物量时，地衣芽孢杆菌受到抑制，而后又有所回升；地衣芽孢杆菌与隐藻混合培养组中，菌和藻的生物量显著负相关r=-0.894，P=0.003 （在α=0.01 水平下线性关系显著），在培养的前2 d 藻细胞密度较低时，地衣芽孢杆菌受到促进，随着藻细胞密度的增大，地衣芽孢杆菌逐渐被抑制，第16 d 菌的生物量为2.3×104CFU·mL-1；地衣芽孢杆菌与颤藻混合培养组中，菌和藻的生物量显著负相关r=-0.765，P=0.027（在α=0.05水平下线性关系显著），地衣芽孢杆菌一直被抑制，其生物量在第16 d 为0.2×104 CFU·mL-1。

对虾养殖池水培养液中地衣芽孢杆菌生物量变化如图8 所示。实验周期中地衣芽孢杆菌单培养的生物量远远高于菌藻混合培养组，最高生物量达到54×104 CFU·mL-1；地衣芽孢杆菌与微绿球藻混合培养组中，菌和藻的生物量线性关系不显著（r=-0.386，P=0.345），菌的生物量在4.1×104~7.3×104 CFU·mL-1 之间波动；地衣芽孢杆菌与隐藻混合培养组中，菌和藻的生物量线性关系也不显著（r=-0.331，P=0.423）；地衣芽孢杆菌与颤藻混合培养组中，培养初期地衣芽孢衣芽孢杆菌与隐藻混合培养组中，菌和藻的生物量显著负相关r=-0.894，P=0.003 （在α=0.01 水平下线性关系显著），在培养的前2 d 藻细胞密度较低时，地衣芽孢杆菌受到促进，随着藻细胞密度的增大，地衣芽孢杆菌逐渐被抑制，第16 d 菌的生物量为2.3×104CFU·mL-1；地衣芽孢杆菌与颤藻混合培养组中，菌和藻的生物量显著负相关r=-0.765，P=0.027（在α=0.05水平下线性关系显著），地衣芽孢杆菌一直被抑制，其生物量在第16 d 为0.2×104 CFU·mL-1。对虾养殖池水培养液中地衣芽孢杆菌生物量变化如图8 所示。实验周期中地衣芽孢杆菌单培养的生物量远远高于菌藻混合培养组，最高生物量达到54×104 CFU·mL-1；地衣芽孢杆菌与微绿球藻混合培养组中，菌和藻的生物量线性关系不显著（r=-0.386，P=0.345），菌的生物量在4.1×104~7.3×104 CFU·mL-1 之间波动；地衣芽孢杆菌与隐藻混合培养组中，菌和藻的生物量线性关系也不显著（r=-0.331，P=0.423）；地衣芽孢杆菌与颤藻混合培养组中，培养初期地衣芽孢杆菌生长快速，但第2 d 起即受到明显的抑制，菌和藻的生物量呈显著的负相关（r=-0.889，P=0.003）。

通径分析结果如表1 所示。微绿球藻生物量（Xn）对颤藻生物量（Yo）的直接作用为1.477，但地衣芽孢杆菌生物量（Xb）对微绿球藻生物量（Xn）的负作用减弱了微绿球藻生物量（Xn）对颤藻生物量（Yo）的正作用，所以微绿球藻生物量（Xn）对颤藻生物量（Yo）的总作用为0.902 3，小于其直接作用。同样，微绿球藻生物量（Xn）n 对地衣芽孢杆菌生物量（Xb）的负作用使地衣芽孢杆菌生物量（Xb）成为主要的限制因子（即限制颤藻生物量（Yo）变化的主要因素）。颤藻和微绿球藻及地衣芽孢杆菌间的多元线性回归模型为
y=-29.421+0.217Xn+5.262Xb（R2=0.849，F=14.038，P=0.009）

通径分析结果如表2 所示。隐藻生物量（Xc）对颤藻生物量（Yo）的直接负作用较小，为-0.004，而地衣芽孢杆菌生物量（Xb）对隐藻生物量（Xc）的正作用加强了隐藻生物量（Xc）对颤藻生物量（Yo）的总作用，也加强了地衣芽孢杆菌生物量（Xb）对颤藻生物量（Yo）的总作用，但不明显。地衣芽孢杆菌生物量（Xb）的决定系数远大于隐藻生物量（Xc），说明地衣芽孢杆菌生物量（Xb）是主要的决策变量，也就是说，地衣芽孢杆菌生物量（Xb）是对颤藻生物量（Yo）的主要影响因子。颤藻与隐藻、地衣芽孢杆菌间的多元线性回归模型为y=32-0.002Xc-4.326Xb（R2=0.885，F=19.240，P=0.004）

通径分析结果如表3 所示。微绿球藻生物量（Xn）对颤藻生物量（Yo）的直接作用为-0.454，但地衣芽孢杆菌生物量（Xb）与微绿球藻生物量（Xn）的相关系数为-0.959，因此抵消了微绿球藻生物量（Xn）对颤藻生物量（Yo）的负作用。地衣芽孢杆菌生物量（Xb）与隐藻生物量（Xc）的相关系数为-0.163，同样抵消了隐藻生物量（Xc）对颤藻生物量（Yo）的负作用。从各变量对颤藻生物量（Yo）的总作用来看，微绿球藻生物量（Xn）对颤藻生物量（Yo）的总作用最大，而地衣芽孢杆菌生物量（Xb）对颤藻生物量（Yo）的负作用最大。从决策系数R2（i）来看，地衣芽孢杆菌生物量（Xb）为主要决策因素，而微绿球藻生物量（Xn）为主要限制因素（即微绿球藻生物量（Xn）限制了颤藻生物量（Yo）的变化）。颤藻和微绿球藻、隐藻及地衣芽孢杆菌间的多元线性回归模型为y=47.563-0.166Xn-0.241Xc-5.442Xb （R2=0.879，F= 9.675，P= 0.026）。

微藻与细菌之间的关系复杂，在有光的情况下微藻通过光合作用吸收二氧化碳产生氧气，细菌则通过呼吸作用吸收氧气放出二氧化碳，从这方面看，两者是相互促进的；但在黑暗中微藻与细菌都只进行呼吸作用，这时两者又是相互竞争的。除此之外，微藻和细菌也通过胞外产物、营养物质循环等方面相互作用。不同的微藻也有不同的生理特性，本实验所选用的3 种微藻分别来自不同的门，生理特性差别较大，这就使它们与地衣芽孢杆菌的作用结果不尽相同。微绿球藻在密度低时受到地衣芽孢杆菌的促进作用，而密度升高后被地衣芽孢杆菌所抑制；隐藻则一直受到地衣芽孢杆菌的明显促进作用；地衣芽孢杆菌对颤藻的作用程度小，加菌组和不加菌组的颤藻生物量差异不显著。

在单种微藻与地衣芽孢杆菌混合组中，培养初期微绿球藻和隐藻的细胞密度较低时地衣芽孢杆菌的生物量都有一定程度的增加，在微藻的指数增长期，随着藻细胞密度的增大，地衣芽孢杆菌渐渐受到抑制，但在培养后期微绿球藻组的地衣芽孢杆菌又有一定程度的增加。何曙阳和饶行[13]指出藻类在指数生长期释放出的有机物含量很少，进入稳定增长期后，开始大量释放胞外产物，到稳定增长期后期，开始出现细胞的死亡和溶解，使水体中有机物含量迅速增加，这可能也是与微绿球藻混合培养后期地衣芽孢杆菌生物量增加的原因。在与颤藻混合培养中，地衣芽孢杆菌均受到抑制。郑莲等[14]研究两种微藻对凡纳滨对虾养殖环境中细菌数量变化的影响，结果发现，微藻增加到一定密度时能够抑制弧菌的生长，这与本实验的研究结果类似。从这3 种微藻对地衣芽孢杆菌的影响对比来看，颤藻对地衣芽孢杆菌的抑制是通过其胞外产物作用的，而非通过营养物质的竞争而产生作用的。

无机培养液和对虾养殖池水这两种培养液中，地衣芽孢杆菌对微藻的作用结果无明显变化。但在培养初期，对虾养殖池水中地衣芽孢杆菌对微绿球藻的促进作用更为明显，中后期对隐藻的促进作用更显著。笔者认为，地衣芽孢杆菌的作用力之所以得到提高，与培养液中的有机物有很大关系，对虾养殖水的无菌对照中的地衣芽孢杆菌生物量远远高于无机培养液组恰恰证明了该结论。

通径分析（Path Analysis）是研究变量间相互关系、自变量对因变量作用方式、程度的多元统计分析技术。地衣芽孢杆菌和其他微藻对颤藻直接和间接的作用可以用通径分析法进行分析。表1中微绿球藻生物量（Xn）和地衣芽孢杆菌生物量（Xb）对颤藻生物量（Yo）的直接作用为正，而表3 中为负值，这是因为微绿球藻+颤藻+地衣芽孢杆菌混合培养组的总生物量较小，几种微生物间相互促进，而微绿球藻+隐藻+颤藻+地衣芽孢杆菌混合培养组的总生物量较大，微生物之间形成了竞争。所以在微藻与微藻之间、微藻与细菌之间不存在胞外产物相互作用的情况下，要想使某种微藻受到抑制，就要使总生物量达到一定的密度，这样才使它们因竞争而产生抑制作用，而在密度较低时产生的作用往往是相互促进。从表3 可以看出，微绿球藻和地衣芽孢杆菌对颤藻的作用较大，从它们对颤藻的总作用来看，微绿球藻促进颤藻的生长，而地衣芽孢杆菌抑制颤藻。但从决策系数R2（i）来看，地衣芽孢杆菌为主要的决定因素，而微绿球藻为主要的限制因素，这说明这两种微生物对颤藻所产生的主要作用都是通过其他生物来产生作用的。李卓佳等（2002）[7]研究斑节对虾养殖池塘藻-菌关系，发现在池塘中施用一定量的地衣芽孢杆菌对蓝藻具有抑制作用。从本实验的分析结果看，地衣芽孢杆菌不是直接抑制蓝藻，而是其他微藻在地衣芽孢杆菌的作用下对蓝藻产生抑制作用或者说是地衣芽孢杆菌间接抑制蓝藻。在水产养殖过程中在养殖水体定期补充地衣芽孢杆菌，使其他有益微藻在地衣芽孢杆菌的协同作用下取得竞争优势，可能会成为抑制颤藻爆发的有效途径。