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标题: 原创技术贴之四-自己扩培发酵活菌的误区 [打印本页]

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-6 15:33
标题: 原创技术贴之四-自己扩培发酵活菌的误区
本帖最后由 horsegreenhill 于 2016-4-6 15:50 编辑

自己扩培发酵活菌的误区

中国海洋大学水产微生物

马青山博士

受到病害、台风及价格行情等因素的影响，今年水产养殖行业有些惨淡。养殖户通过多种方式控制成本，而自行扩培发酵活菌就是其中之一。不少养殖户自己捣鼓发酵，也有挺多这种形式的套装产品，但我发现在扩培的过程中存在挺多的误区和问题。下面就同大家进行分享：

1、关于扩培的菌种

所使用微生物种类：

我在下面转市场发现，现在好像什么菌种养殖户都能扩培、什么菌种的产品扩培套餐都有，EM、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、光合细菌都全乎了。但我只推荐大家自己扩培乳酸菌、光合细菌，为什么呢？首先大家要注意，自己扩培最重要的是不能染杂菌！而乳酸菌兼性厌氧，并且扩培好的pH在4-5左右，一般杂菌难以生长；而光合细菌厌氧扩培，且培养基组分相对缺乏营养，也不易染杂菌。

下图是养殖户自己扩培的乳酸菌，密封发酵，扩培20h，扩培出来发酵液的活菌数我也跟着测了，有10[sup]8[/sup]cfu/ml，基本没有杂菌。所以说，厌氧密封的条件下，扩培还是比较容易成功的。

file:///C:/Users/DBN-PR~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg

不过，像EM、芽孢杆菌等，它们是需氧菌，也就是说你扩培的时候要敞着盖，某些产品说明书里还让大家通气、搅拌，这不就相当于接种杂菌么？另外，这两种菌扩培的pH在7左右，一般杂菌都能生长，整不好就扩培出有致病性的微生物，所以不建议自己扩培，不过大家倒是可以在使用前加点红糖，活化个2-4个小时泼洒，既不染菌，又增强了芽孢杆菌的活力。

下图是养殖户自己扩培的EM菌，大家可以看到其表面漂浮一层厚厚的白膜，这层白膜主要由需氧菌组成，理想的情况下是一些枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，这样用起来倒是没什么坏处；但也不排除可能是某些致病需氧菌，那就比较麻烦了。所以自己扩培需氧菌，风险还是比较高的。

file:///C:/Users/DBN-PR~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image004.jpg

菌种可用代数：

除光合细菌外，其他自己扩培的活菌不建议留种，原因有二：1、易染杂菌；2、菌种活力欠佳。而光合细菌菌种扩培最好控制在4代以内，4代以上，菌种活力明显下降。

2、关于扩培的培养基

扩培的培养基一般有两个来源，一个是养殖户自己配制的，另一个是产品套装里带的，但不管是哪一种，都离不开一股子糖蜜味，为啥？1、糖蜜便宜；2、糖蜜提供碳源；3、扩培的发酵液一股香甜的糖蜜味，养殖户感觉味道好。但真正的扩培培养基是不加糖蜜的，大家可以看看下面的培养基：

实验室扩培芽孢杆菌、EM菌：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，配制1L培养基；

实验室扩培乳酸菌：

酪蛋白胨 10g、酵母提取液 5g、葡萄糖 5g、乙酸钠 5g，配制1L培养基；

这种培养基可以迅速让微生物扩培生长，且营养均衡，能够达到较高的活菌数，但相对来讲会比糖蜜为主的培养基贵，不过，若大家直接去淘宝买大包装，也能便宜不少。

3、关于扩培的方法

之前已经提到，微生物扩培发酵最需要注意的地方就是要严格控制杂菌的污染，而这里提到的扩培方法也主要是这方面的一些注意事项。

（1）扩培活菌所用的桶、盆等容器最好消消毒，所用的水最好加热灭下菌。

（2）不同微生物有自己适合生长的温度，一般而言，扩培建议在25摄氏度左右，比较适合现在应用较多的乳酸菌、芽孢杆菌等的生长。

（3）为了防止污染，乳酸菌、光合细菌密封发酵，发酵期间不要搅拌；EM、芽孢杆菌等需氧菌发酵过程需要搅拌的，建议每桶配一根棍子，防止交叉污染。

（4）每次取用后要严格密封放在阴凉遮阳处存放，需要长时间保存最好分装在小容器中。

4、扩培终点的判断

不同的菌种，扩培终点的判断方法有所不同。一般而言，养殖户主要通过闻味道对发酵终点进行判断，除某些光合细菌外，扩培出来的发酵液味道以酸香味、酵香味为主，出现馊味、腐败味道，可能污染杂菌，建议不要使用。

除了闻味道，养殖户也可以自己测测pH值，像乳酸菌发酵终点pH值一般为4-5左右，芽孢杆菌、EM、光合细菌pH值一般为7-8左右。

最后，有条件的养殖户最好能用显微镜镜检一下，40物镜×10目镜即可清晰看到乳酸菌、芽孢杆菌等微生物，取发酵液自己看看，到底有多少微生物，是球的，还是杆的，等等。总之，有了显微镜可以更好地判断发酵好坏及发酵终点，具体方法就不在这里展开了，有需要的可以直接联系我详聊（QQ：416063411）。

注：此文属个人原创，谢绝转载！

作者: 渔歌子 时间: 2016-4-7 09:39
感谢马博士的分享！

作者: 涛家强 时间: 2016-4-7 14:27

感谢楼主的分享！

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-7 15:15
不客气，有问题可以直接交流！

作者: jinlimin1 时间: 2016-4-8 09:15
请教400倍显微镜怎么看乳酸菌、芽孢杆菌等微生物？

作者: 蟹将 时间: 2016-4-8 10:03
的确是博士级别的但是这个培养配方不适合养殖户，而且自己培养EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌数量级达到十亿。

作者: 蟹将 时间: 2016-4-8 10:21
本帖最后由渔歌子于 2016-4-8 11:20 编辑

这篇文章可能有一些不妥的地方，提提意见

1. 乳酸菌发酵时间才20h,就来进行质量评价，不科学，起码发酵96小时以上再评价比较妥当

2. 实验室扩培芽孢杆菌、EM菌：
胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，配制1L培养基；这个配方是经典的培养大肠杆菌的配方，但是拿来发酵培养芽孢杆菌，EM菌，是不是有点太儿戏了，大量的碳源在哪儿？

3、第二个配方里面用到了葡萄糖，以前养殖户都喜欢往水里泼葡萄糖，现在基本很少了，为什么？很多人认为是弧菌比较喜欢吃单糖，泼到水里培养弧菌了。现在养殖户培养乳酸菌、EM菌爱用红糖，跑塘口多的话，这个不得不提。

4. 现在大部分EM菌还是采取厌氧发酵的，不需要搅拌需要密封，最终成品pH 在3-3.5，如果是7-8看谁敢用。（另外现在水产上售卖的EM菌，其实是大多数是以乳原来酸菌、酵母菌、等一些菌复配出来的，原来传统说法80多种菌的EM菌只是一个传说）

5。显微镜下，除非酵母菌、粪链球菌之类的特殊形态菌，在400倍下想区分是乳酸菌还是什么其他杂菌，还是洗洗睡吧，但是如果有显微镜，看见很多菌，而且pH也很低，那基本上发酵是成功了。所以测量pH是发酵乳酸菌 EM菌的最简单方法，低于3.5即可

只是探讨，水产行业需要多种声音，我说的也不一定是对的，只是因为实践过，所以说说意见。

作者: vanadis 时间: 2016-4-8 14:09
自己扩培益生菌的技术门槛并不是太高，就是就点麻烦，其次是生产上和使用时间对不上号。像一些常规益生菌完全可以用自己扩培，比如乳酸菌，光合菌

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:17

蟹将发表于 2016-4-8 10:21
这篇文章可能有一些不妥的地方，提提意见

1. 乳酸菌发酵时间才20h,就来进行质量评价，不科学，起码发酵 ...

非常感谢您的回复，有不同声音、有争论、有交流才会进步。我也对您提出的意见进行逐一回复：

1、其实菌种扩培所需要的时间同菌种、培养基及所处的环境关系非常大，您说的96小时是不是温度较低？用的糖蜜等缓释碳源？如果菌种活力足够，培养基营养充分，且温度30摄氏度左右，20小时是可以完成扩培的。

2、没错，这确实是经典的LB培养基，培养大肠杆菌、芽孢杆菌都没有问题的。其中胰蛋白胨既可以提供氮源，又可以提供碳源。
3、我这里提到的是养殖户自己扩培菌，并不是泼洒葡萄糖，泼洒葡萄糖那确实是非常危险的。扩培的过程中，如果用葡萄糖作为碳源，其效率远高于糖蜜，这也说明了为什么我之前20小时左右就能发酵好，但一定要把握好扩培火候与杂菌控制。

4、这点我非常赞同，以乳酸菌为主的EM还是比较靠谱的，不然扩培染菌风险较高。

5、文章中所提为：通过显微镜的观察能够区分球菌、杆菌、链球菌，及大概判断下菌数目多少，酵母菌大概比常见细菌大10倍左右，400倍放大观察这些内容是没有问题的。但观察细菌需要用结晶紫进行染色，如果想了解这方面的知识，咱们可以详聊。下面我附几张400倍放大的芽孢杆菌、乳酸菌图片。对于咱们养殖户，通过pH来判断发酵是否成功确实是个好办法，显微镜的观察可能需要比较专业的培训。

下图是巨大芽孢杆菌，透明小体为芽孢（10*40，结晶紫染色）

下图是乳酸链球菌，能够观察到呈链状的球形菌（10*40，结晶紫染色）

再次感谢您的回复，希望咱们能够多多交流，共同进步！

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:19

jinlimin1 发表于 2016-4-8 09:15
请教400倍显微镜怎么看乳酸菌、芽孢杆菌等微生物？

需要通过结晶紫染色即可观察，可查看下面回复，有相关照片。

作者: 蟹将 时间: 2016-4-8 14:20

vanadis 发表于 2016-4-8 14:09
自己扩培益生菌的技术门槛并不是太高，就是就点麻烦，其次是生产上和使用时间对不上号。像一些常规益生菌完 ...

是的，如果能赶上扩培和使用周期相当经济，大型养殖场可以尝试

作者: 蟹将 时间: 2016-4-8 14:20

vanadis 发表于 2016-4-8 14:09
自己扩培益生菌的技术门槛并不是太高，就是就点麻烦，其次是生产上和使用时间对不上号。像一些常规益生菌完 ...

的确是这样如果能现培现用那是极好的

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:21

jinlimin1 发表于 2016-4-8 09:15
请教400倍显微镜怎么看乳酸菌、芽孢杆菌等微生物？

需要通过结晶紫染色即可观察，可查看下面回复，有相关照片。

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:22

蟹将发表于 2016-4-8 10:03
的确是博士级别的但是这个培养配方不适合养殖户，而且自己培养EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌数量级达到十亿 ...

您刚才也提到了，现在的EM以乳酸菌为主，这样扩培出来的乳酸菌倒是也不错！

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:22

蟹将发表于 2016-4-8 10:03
的确是博士级别的但是这个培养配方不适合养殖户，而且自己培养EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌数量级达到十亿 ...

您刚才也提到了，现在的EM以乳酸菌为主，这样扩培出来的乳酸菌倒是也不错！

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:27

vanadis 发表于 2016-4-8 14:09
自己扩培益生菌的技术门槛并不是太高，就是就点麻烦，其次是生产上和使用时间对不上号。像一些常规益生菌完 ...

没错，推荐自己扩培，经济、节约成本，这是最大的好处。而且扩培的活菌效果还能更好一些。多多交流！

作者: 蟹将 时间: 2016-4-8 14:28

vanadis 发表于 2016-4-8 14:09
自己扩培益生菌的技术门槛并不是太高，就是就点麻烦，其次是生产上和使用时间对不上号。像一些常规益生菌完 ...

的确是这样如果能现培现用那是极好的

作者: 渔歌子 时间: 2016-4-8 14:31
@东兴展丰卢善明：1、如果菌种在扩培中都长不成优势，都无法抑制有害菌，只能说明该公司的菌种不行。2、扩培的菌好不好取决于菌种，国家标准生产上允许杂菌的存在。

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:47

蟹将发表于 2016-4-8 14:20
的确是这样如果能现培现用那是极好的

在养殖塘口弄个简易发酵罐，怎么样？现用现取

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 14:54

渔歌子发表于 2016-4-8 14:31
@东兴展丰卢善明：1、如果菌种在扩培中都长不成优势，都无法抑制有害菌，只能说明该公司的菌种不行。2、扩培 ...

没错，希望良心公司生产良心菌种，让老百姓都能扩培出优质、高效的益生菌！
菌种只是一方面，另外，培养基好不好？扩培方式对不对？扩培条件合适不合适？都非常重要。

作者: 蟹将 时间: 2016-4-8 16:39

horsegreenhill 发表于 2016-4-8 14:47
在养殖塘口弄个简易发酵罐，怎么样？现用现取

本来就有这样做的很多

作者: horsegreenhill 时间: 2016-4-8 16:43

蟹将发表于 2016-4-8 16:39
本来就有这样做的很多

都有哪些厂家啊？麻烦告知一二，多谢！

作者: 南湖中华鲟 时间: 2016-5-19 11:05
马博出品，必是精品，接地气！

作者: horsegreenhill 时间: 2016-5-19 17:10

南湖中华鲟发表于 2016-5-19 11:05
马博出品，必是精品，接地气！

多谢支持，多多交流！！

作者: duola1028 时间: 2016-5-26 17:26
菌种自培、扩培，最好是在池塘发酵现配现用！

作者: 养殖小散 时间: 2016-6-19 20:56
谢谢分享学习了

作者: 李大少爷 时间: 2016-7-2 11:15
真的不错，学习了，都是技术派

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