苏北地区养殖银鲫“鳃出血病”流行病学初步调查

　　　　
　　中国水产频道独家报道，在患“鳃出血病”的银鲫养殖池塘中使用抗菌药物，只能在用药初期部分地降低银鲫的死亡率。抗生素类药物并不能控制这种疾病的蔓延。
　　　
　　银鲫（Carassius auratus gibelio）是江苏省重要的淡水鱼养殖品种，由于银鲫在江苏省的销售市场好、价格高的原因，几年来，养殖规模和产量均逐年提高，目前全江苏省养殖银鲫总面积已经接近100.0万亩，产值达到50.0亿元人民币左右。
　　
　　随着银鲫养殖业的快速发展，各种病害危害情况也越来越严重，如细菌性败血症、黏孢子虫病等一直是危害银鲫养殖产业的主要疾病。自2009年开始，有一种对养殖银鲫危害极大的“鳃出血病”首先在江苏省射阳的部分水产养殖场出现，这种疾病可以导致养殖银鲫的死亡率高达90.0%以上。目前，该病已经蔓延至江苏省大丰、盐都，扬州宝应、淮安楚州等主要水产养殖区域，至今这种疾病依然呈现出快速蔓延的趋势。
　　
　　为了探讨银鲫“鳃出血病”的起因，从而有效地预防和防治这种疾病，我们对银鲫的“鳃出血病”进行了实验室诊断，并对其进行了流行病学初步调查。
　　
　　一、诊断与调查方法
　

　
　　1、调查进行的时间与地点
　　
　　2011年8-11月和2012年4-10月，在苏北地区的部分水产养殖基地精养池塘收集具有典型症状的银鲫，现场观察、记录其疾病的症状，进行解剖观察，同时取症状基本一致的同批患病银鲫，进行病原细菌分离。
　　
　　2、病原细菌分离与培养
　　
　　在无菌条件下，从具有典型症状患病银鲫的鳃、肝、脾、肾脏等处取样，接种脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）平板上，在25.0-28.0℃恒温培养箱中经36-48 h培养，取菌落形态相同的优势菌落，转接到新的BHIA平板中，进一步纯化培养后，最终获得5个菌株，编号分别为HSYJ-001、HSYJ-002、HSYJ-003、HSYJ-004和HSYJ-005。以灭菌生理盐水洗下菌落并离心集菌，备作对健康银鲫活菌攻毒用的菌液。
　　
　　3、活菌攻毒
　　
　　用于活菌攻毒的试验银鲫从江苏省射阳黄沙港养殖区内采集，选择体表无损伤、色泽正常、游动活泼的银鲫。依据体重将试验银鲫分为2个试验组，体重为（280.0±13.0）g的银鲫作为攻毒试验成鱼组，体重为（87.0±9.0）g的银鲫鱼种作为攻毒试验幼鱼组。从饲养池塘运回的银鲫饲养在试验室内的塑料水族箱（120.0cm×80.0 cm，盛水约500.0 L）中，每个水族箱中饲养10尾鱼。每天按照鱼体重的1.0%投喂银鲫配合饲料（盐城裕达饲料有限公司生产的产品）2次。饲养用水为经过曝气过滤的自来水，试验期间控制水温为（22.0±2.0）℃。
　　
　　将上述收集的分离菌株的菌液以0.7%的灭菌生理盐水稀释，将活菌液的终浓度调节为1.0×106cfu/mL。共收集5个菌株的菌液，将试验银鲫成鱼和幼鱼各分为5个试验组和1个对照组，每组用10尾银鲫。每个试验组注射1个菌株的活菌液，对每尾试验银鲫成鱼经腹腔注射菌悬液0.3 mL，对试验银鲫幼鱼则注射0.2mL；对照组成鱼每尾经腹腔注射0.7%的生理盐水0.3mL，对幼鱼则注射0.2mL，分别作为各试验组的盐水对照组。另设不注射任何物质的空白对照组。攻毒后的试验鱼继续饲养观察20 d，统计死亡率。将出现疾病症状濒临死亡的银鲫，同1、2项的操作，进行致病菌再分离和纯培养后，分别编号为HSYJ-R01、HSYJ-R02和HSYJ-R03。用于药物敏感性测定和致病菌种类的鉴定。
　　
　　4、药物敏感试验
　　
　　按照日本化学疗法学会制定的标准法，针对人工致病后再分离菌株，测定部分渔用抗菌类药物对这些菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。籍以选择治疗疾病的药物和确定给药的剂量。
　　
　　5、野外药物治疗与疗效判定
　　
　　将经过在试管内抑、杀菌试验证明有较好的抑、杀菌效果的烟酸诺氟沙星、氟苯尼考按22.0mg/kg鱼体重的用药量，均匀地拌和在颗粒饲料中制作成药饵，投喂射阳县黄沙港的发阳水产养殖场内已显示出疾病症状的银鲫饲养池，每天投喂1次药饵，连续投喂5 d。其中用烟酸诺氟沙星药饵投喂2个池塘，用氟苯尼考药饵投喂2个池塘，将条件大致一致，发病状况相同的2个池塘定为对照池塘，统计试验和对照池塘在试验期间的死亡鱼数量。自投喂药饲开始后的7 d内观察鱼群活动状况，统计死鱼数量，并对死亡鱼体进行解剖观察，确定其死亡原因。根据各个池塘中死亡银鲫数量，依下式计算药物的有效率（efficacy rate，ER）：参照用药后的有效率，对药物防病的效果进行评价。
　　
　　6、致病菌鉴定
　　
　　从人工感染致病出现典型症状银鲫体内再分离的菌落中，挑取菌落形态基本相同，表面光滑、中间微隆起，边缘整齐，直径约0.1-0.2mm的呈乳白色的半透明优势菌落，转接到新的BHIA平板中，做进一步纯化培养，获得。随后参照《伯杰氏系统细菌学手册》的分类特点要求对分离菌株进行鉴定。
　　
　　7、流行病学调查
　　
　　采用现场调查、访问相结合的方法进行。
　　
　　8、病毒性病原的探讨
　　
　　取出具有典型症状的银鲫鳃组织和肝、脾、肾脏等内部器官，匀浆后取上清液经孔径为0.22μm的滤菌膜过滤，制备滤菌上清液样品；加入青霉素和链霉素，制备药物杀菌上清液样品；置于100℃水浴锅中并保持1 h，制备加热杀菌上清液样品。分别经过胸鳍基部注射的方法，对银鲫成鱼和幼鱼接种上述各种组织浆上清液，作为试验组。注射未经处理的患病鱼组织上清液样品的试验鱼作为病鱼组织对照组；注射未经处理的正常鱼组织上清液样品的试验鱼作为正常组织对照；将注射0.7%的灭菌生理盐水的试验鱼作为盐水对照组。注射结束后仍然放回水族箱中继续饲养观察试验鱼发病与否（这部分内容已经另文报道）。

 

　　
　　二、结果
　　
　　1、根据病鱼做出的诊断
　　
　　银鲫“鳃出血病”受感染的个体大多是体重在100.0g以上的成鱼。主要症状表现为体表充血，尤其是鳃部严重充血，下颌等体表处分布大量点状出血点，如果将濒死病鱼提离水面时，其鳃部开始大量地出血，血液会不断地顺着鳃丝流到体外（图1）。
　　
　　将病鱼解剖后可见其肝脏、脾脏、肾脏肿大，有出血点（图2），严重时鱼鳔分布大量出血点。在养殖现场观察结果证明，处于患“鳃出血病”初期的银鲫，其摄食异常活跃，而且死亡过程比较短暂，即死亡速度很快。
　　
　　2、经分离菌株活菌攻毒后银鲫病变与死亡率
　　
　　经过对健康银鲫接种从患“鳃出血病”银鲫体内分离的5个菌株的菌液后，试验银鲫的成鱼和幼鱼出现的死亡率见表1。由表1所示，人工注射活菌液后银鲫成鱼的死亡率为70.0%- 100.0%，2个对照组则没有出现任何死亡；而银鲫幼鱼的死亡率80.0%-100.0%，2个对照组没有出现任何死亡。受感染后大多数银鲫出现的症状为体表充血，解剖后可见腹腔中有大量腹水。但是，所有濒临死亡的银鲫并没有出现由鳃部大量地出血的症状，即未见血液不断从鳃丝流出的银鲫个体。
　　
　　3、分离菌株对抗菌药物的敏感性
　　
　　利用抗菌药物对3个再分离菌株完成的药物敏感性测定结果如表2所示。由表2可以看出，除对个别药物（如硫酸庆大霉素）外，3个再分离菌株对各种药物的敏感程度尚比较一致。所有分离菌株均对恩诺沙星、烟酸诺氟沙星和盐酸土霉素比较敏感，其次是氟苯尼考和硫酸新霉素的抑菌效果稍好，硫酸庆大霉素的抑菌效果不如前几种药物的抑菌效果，但是也比硫氰酸红霉素和氨苄青霉素的抑菌效果稍好。
　　
　　4、野外用药效果
　　
　　根据药物敏感试验测定结果，选用盐酸土霉素和烟酸诺氟沙星作为野外治疗疾病的药物，用于池塘患病银鲫治疗结果如表3所示。由表3可以看出，与未用药物的对照池塘相比，用药的池塘死亡率上升速度比较缓慢，尤其是用药初期，池塘中银鲫的总死亡量有一段时间是有所下降的。但是，并不能完全控制患病银鲫的死亡。
　　
　　5、病原菌鉴定
　　
　　对3个再分离菌株的生理、生化特性测定结果如表4所示。由表4可以看出，3个分离 菌株的形态和生化特性的测定结果完全一致，并且与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydropHila）的生化特性完全一致，因此，这3个分离菌株应当归属于A. hydropHila。
　　
　　6、疾病流行的一些特征
　　
　　（1）流行季节
　　
　　银鲫“鳃出血病”主要在4-6月和8-11月初流行，其中5月和10月分别为两个流行期的高峰期。
　　
　　（2）流行水温
　　
　　根据本次调查的结果，当水温处于上升期时，银鲫“鳃出血病”流行的适宜水温范围为15.0-26.0℃，即当池塘水温自然上升至15.0℃时，疾病开始发生，而继续上升至26.0℃或者以上时，这种疾病就几乎停止发生；当水温进入下降期，即使池塘水温尚处于26.0℃以上，这种疾病也是可以发生的。
　　
　　（3）养殖模式
　　
　　发生银鲫“鳃出血病”的池塘，主要是单养银鲫或者是主养银鲫的池塘，混养银鲫的池塘较少发生这种疾病。
　　
　　（4）发病规格
　　
　　发生“鳃出血病”的银鲫规格大多在100.0g以上的个体，小规格鱼种较少发生这种疾病。
　　
　　（5）危害性
　　
　　银鲫的“鳃出血病”是近年来在江苏暴发的一种恶性传染病。江苏射阳、大丰等地精养池塘，连续几年不同程度出现这种疾病，死亡率一般为20.0%-30.0%。严重时可达90.0％以上，甚至导致整个池塘中银鲫全部死亡的事例也有发生。
　　
　　三、讨论
　　
　　1、关于致病病原推测
　　
　　利用从患“鳃出血病”银鲫体内分离的致病菌株，人工感染健康银鲫后，虽然能致使受感染银鲫出现体表大量出血的症状。但是，人工感染致病菌的试验鱼却并未出现与自然条件下发生的“鳃出血病”相同的血液从鳃丝大量流出的症状。预示着分离菌株所致疾病与自然条件下发生的“鳃出血病”是有区别的。
　　
　　采用对致病菌株敏感的抗菌类药物在野外治疗患“鳃出血病”的结果表明，用药初期能部分降低池塘中银鲫的死亡数量，但是，对患病银鲫使用抗菌素乐药物既不能控制疾病的蔓延也不能完全控制银鲫的死亡。这种结果是否预示着至少有部分银鲫的死亡是由于病毒与细菌混合感染的缘故？尚值得进一步研究。
　　
　　我们利用患病银鲫组织浆人工感染健康银鲫的方法，对银鲫“鳃出血病”病原初步调查结果证明，该病是由于某种病毒性病原引起的。已经有人指出银鲫“鳃出血病”的病原是鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）。国外也还有人将这种病毒称为金鱼疱疹病毒（Goldfish herpes virus，GHV），或者疱疹病毒性出血性坏死病毒（Herpesviral Haematopoietic Necrosis virus，HHNV）。
　　
　　根据相关资料，这种病毒最初是1992年在日本国爱知县（Aichi prefecture）被发现的。随后，在台湾、美国、澳大利亚和英国等地均已有报道。根据这些已经报道的资料，这种病毒主要是感染金鱼（Carassius auratus L.），而引起银鲫的大面积暴发疾病，还只是限于我国的江苏省苏北等地。关于苏北地区这种病毒的来源，也是值得深入研究的课题。
　　
　　2、预防措施及其建议
　　
　　迄今为止，对于水产养殖动物的病毒性疾病尚无有效的治疗药物。由呼肠孤病毒引起的草鱼（CtenopHaryngodon idellus）出血病，人们可以通过制备各种疫苗进行有效地预防，特别是利用病鱼组织浆制备的灭活疫苗，由于制备方法简单，已经被我国部分养殖草鱼较多的地区广为采用。不过，我们参照草鱼出血病组织浆疫苗的制备方法，制备银鲫“鳃出血病”组织浆灭活疫苗，接种银鲫以后却未获得相应的免疫保护力。在尚未找到有效控制银鲫“鳃出血病”的方法之前，以下措施已经被证明对预防银鲫“鳃出血病”是有效的。
　　
　　（1）改变养殖方式
　　
　　改变单养银鲫的模式，将银鲫与各种养殖鱼类或者凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）等混养。
　　
　　（2）投喂免疫增强剂
　　
　　在饲料中添加免疫增强剂，在疾病流行之前定期投喂，以增强养殖银鲫自身的非特异性免疫机能，可以通过提高自身抗病能力而达到预防疾病的效果。
　　
　　（3）避免滥用药物
　　
　　利用药物敏感性试验等方法，对市场上购买的消毒剂、抗菌和杀虫剂等各种渔用药物，通过药物敏感试验进行筛选，保证其质量可靠。一旦使用就能达到相应的疗效。
　　
　　（4）减少应激性刺激
　　
　　改变过去用药习惯，通过监测水产养殖动物体内、外病原体的数量，决定是否需要使用消毒剂或者杀虫药物。尽量减少养殖过程中的用药量与用药次数。避免药物对养殖鱼类的刺激。
　　
　　（5）投喂优质饲料
　　
　　投喂质量优良的饲料，避免“病由口入”，同时减少使用劣质饲料造成的对养殖水体的污染。（文/ 华中农业大学水产学院 陈昌福 盐城裕达饲料有限公司 孟宪东 陈亮波 金玲 江苏省射阳惠裕饲科技有限公司 郭庆）

 

 

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