鱼粉及乌贼内脏粉中硝基呋喃代谢物等现状调查

珊瑚海

（转自水产前沿）
吴秀峰，薛敏(中国农业科学院饲料研究所，国家水产饲料安全评价基地，北京，100081)一、背景
1、硝基呋喃类
    硝基呋喃类抗生素(nitrofuran antibiotics)主要是指呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃西林(nitrofurazone)、呋喃妥因(furantoin)和呋喃它酮(furaltadone)，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用。这类抗生素曾经被广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗，部分品种具有促生长的作用，曾被用作药物饲料添加剂。硝基呋喃类药物及其对应的代谢产物有呋喃唑酮(AOZ)、呋喃它酮(AMOZ)、呋喃西林(SEM)和呋喃妥因(AHD)。但有关研究证明，硝基呋喃类药物及其代谢物具有较强的毒副作用，能诱导有机体基因突变，有致畸胎的诱导作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视。美国和日本分别于1975年、1977年禁止呋喃唑酮作为医药使用。美国1993年禁止呋喃唑酮作为兽药。欧盟在1995年禁止使用呋喃西林，从1997年开始将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发[2002]1号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。
    呋喃唑酮(AOZ)为硝基呋喃类药物中最具代表性的一种，以呋喃唑酮(AOZ)为例，动物服用呋喃唑酮后，原药分子在动物体内迅速代谢，其在体内的稳定性不超过几小时；代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，结合态可长期保持稳定，从而延缓原药在体内的清除速度。而普通的食品加工方法( 如烧烤、微波加工、烹调等)难以使蛋白结合态呋喃唑酮残留物大量降解，食用含有该残留物的肉制品会对人体产生一定的毒副作用。研究表明：蛋白结合态的呋喃唑酮残留物含有称为3-氨基-2-唑酮(AOZ)的完整侧链，在人和动物胃的酸性条件下，侧链可以从蛋白结合态的母体分子上解离下来，AOZ可以代谢成为β-羟乙基肼，该代谢物是强致突变和致癌化合物。同样硝基呋喃类物质的其他代谢物AMOZ、SEM、AHD等都能在体内与细胞膜蛋白结合形成稳定的结合态长期存在，对人体产生毒副作用。徐维海（2005）在罗非鱼肌肉中呋喃唑酮和AOZ的含量分别在停药6 小时后和停药“零时”达到最高，24 小时后呋喃唑酮含量就低于检出限，而肌肉中AOZ的含量在528 小时后才低于1μg/ kg，肌肉中呋喃唑酮和AOZ的消除半衰期分别为9134小时、3812 小时，这表明鱼肌肉中呋喃唑酮代谢很快，而AOZ却很难消除。
    蒋原等（2008）用10μg/mL浓度的硝基呋喃类药物溶液浸泡克氏螯虾给药1小时，然后在不同时间段采样，运用HPLC /MS/MS检测和分析硝基呋喃类药物代谢物在克氏螯虾肌肉、腮和肝胰腺中的消除规律。结果发现硝基呋喃类药物的代谢物在克氏螯虾鳃中药物起始浓度最高，其次是肝胰腺，最后是虾肉。克氏螯虾体内的4种硝基呋喃类药物代谢物，在2-4 小时下降速度最快，4 小时以后下降速度呈减缓的趋势。经过336 小时后，该类药物浓度降低到仪器检测低限以下。结果提示，一旦克氏螯虾被硝基呋喃类药物污染，很难在短时间内消除，增加了产品出口时的风险。
    尽管如此，由于硝基呋喃类药物价格便宜，药效快，目前也仍有大量养殖户违禁使用呋喃类物质药物，导致出口的畜产品和水产品由于呋喃类药物检出而就地销毁的事件屡有发生。
2、孔雀石绿
    孔雀石绿（Malachite green，MG）属三苯甲烷类染料，化学名称四甲基代二氨基三苯甲烷，在水产养殖中孔雀石绿主要用来抗真菌感染和杀灭寄生虫，一般用于鱼类防治水霉病、烂鳃病以及寄生虫等。因其价格低廉、疗效显著，曾在水产养殖业中广泛应用。孔雀石绿进入水生动物体内后，会快速代谢成脂溶性的无色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)。但研究发现：孔雀石绿的化学官能团三苯甲烷是一种致癌物质，并能在鱼体内长时间残留，可通过食物链对哺乳动物和人类产生致畸、致癌、致突变等作用，同时含孔雀石绿的养殖废水排放会污染水环境。
    孔雀石绿及其代谢物具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，其已被全球大部分国家禁止在养殖业中的使用。欧盟法案2002/675/EC规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2μg/kg；日本的肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留；我国也明确禁止在食用动物中使用孔雀石绿。
    Meyer等（1983）的研究结果表明：用孔雀石绿处理过的虹鳟卵孵化后，能引起鱼的头、尾和鳍条等出现畸形，并导致染色体变异。Srivastava等（1995）阐述了孔雀石绿对鲈（Micropterus salm onides）卵死亡率的影响，孔雀石绿浓度增加2倍，鲈卵和鱼苗死亡率增加了20倍。说明孔雀石绿的毒性较强，用于鱼卵及鱼苗的消毒存在较大的风险。Ross等（1985）研究发现，孔雀石绿还可引起虹鳟呼吸抑制的现象。
    孔雀石绿可在鱼体组织内残留，主要积累靶器官包括肝、肾、肌肉、皮肤及其它内脏组织中。Bauer等（1988）报道，鱼暴露于孔雀石绿水溶液后，会很快从水中大量吸收孔雀石绿，并代谢成简单的无色化合物—无色孔雀石绿，大约90%以无色孔雀石绿的形式贮藏在肌肉组织中。有色孔雀石绿在体内消除快，而无色孔雀石绿消除则很慢，在虹鳟鱼肌肉中无色孔雀石绿的半衰期在10天到40天范围内变动，其在组织中的消除率很大程度上取决于鱼体内的脂肪含量。在虹鳟鱼苗中，孔雀石绿及其代谢产物总的半衰期是13天。曲志娜等（2008）采用超高效液相色谱-串联质谱法，对用浓度为800ng/ml的孔雀石绿溶液药浴1h的大菱鲆进行连续采样监测。结果表明，孔雀石绿在大菱鲆的肌肉中代谢较快，其含量降至检测限以下需要20.3天，而其代谢物隐色孔雀石绿存留时间长，消除过程缓慢，需长达281.9-356.7天。
    近年来，我国出口的鳗鱼等和国内市场中的大菱鲆（俗称“多宝鱼”）、鳜鱼（桂花鱼）等产品中相继被检出孔雀石绿残留，这给水产品市场带来了很大的冲击，国外主要水产品进口国，借机对我国出口水产品进行限制，暂停进口我国淡水产品，包括鳗鱼在内的淡水产品出口一度停滞，对我国的水产业造成严重影响，水产品中孔雀石绿的残留问题已成为社会关注的焦点之一。
二、市场调查
    鱼粉的主要原料为海洋捕捞的野生鳀鱼，鲱鱼，沙丁鱼等，原则上不应该检出硝基呋喃类抗生素或孔雀石绿。但由于我国每年鱼粉需求量超过100万吨，市场上流通的鱼粉来源和质量差异非常大，掺杂现象也比较普遍，特别是以淡水鱼鱼粉的掺杂很可能造成饲料被硝基呋喃或孔雀石绿污染的现象。此外，乌贼内脏粉也是饲料企业难以品控的一种原料。基于此， 2008年2月-10月中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料评价基地对国内大中型饲料企业使用的鱼粉及乌贼内脏粉进行随机取样并检测硝基呋喃代谢物和孔雀石绿，以期对我国市场上不同来源的鱼粉及乌贼内脏粉的安全现状进行调查。
三、调查结果
    2008年，共随机抽检37个样品。其中鱼粉29个，乌贼内脏粉7个，虾糠1个。进口鱼粉的产地涉及秘鲁、巴基斯坦、阿根廷、美国、俄罗斯、智利、越南及马来西亚等国，国产鱼粉的产地主要为山东省、浙江省、河北省和大连市。乌贼内脏粉的产地来自日本及我国的浙江省。
    由于硝基呋喃类药物原药在动物体内的稳定性只有数小时，故测定硝基呋喃类原药意义不大。而其代谢物可与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物质。采用LC-MS/MS法，定量限为：0.5μg/kg。检测结果：37个样品中的硝基呋喃代谢物的检出率为0。说明目前在我国市场上流通的鱼粉产品被硝基呋喃代谢物污染的几率比较低。
   孔雀石绿及其代谢物的测定方法采用GB/T19857-2005，检出限：0.5μg/kg。孔雀石绿及其代谢物的检出率相对较高。37个样品中孔雀石绿及其代谢物的检出率达到32.4%。最高的1个样品检出孔雀石绿70767.6μg/kg和无色孔雀石绿62787.8μg/kg。从检测结果可以看出，孔雀石绿及其代谢物出要出现在国产鱼粉中，进口鱼粉中产自越南和智利的2个样品有微量检出，可能由流通环节中掺杂产生。在乌贼内脏粉和虾糠中未检出，具体结果见附表。
四、分析原因及建议
1、原因
    鱼粉中含有高浓度孔雀石绿的主要原因是掺假。例如在进口鱼粉中掺杂以水产品加工的副产品加工的淡水鱼鱼粉可能导致较高的孔雀石绿含量；另一种可能是曾经被孔雀石绿污染的池塘、河流及海域导致该地域的天然鱼类被孔雀石绿污染，以此为原料进行生产的鱼粉，含有微量的孔雀石绿，但后者的可能性较低。
2、建议
    2002年，我国在水产养殖中禁止使用孔雀石绿。但由于之前较为广泛地应用于水生动物的防病治病中，以及作为工业性染料，可能在水体、底泥和河流的沉积物中仍然具有相当量的孔雀石绿沉积，孔雀石绿在环境中残留时间长，对多数水生动物有较强毒性，对生态环境造成了严重的破坏。因此，国内不仅要对其检测方法进一步加以改进，监控环境中的孔雀石绿含量，而且应大力研究从池塘水体中清除孔雀石绿残留物的方法，并尽快开发出安全而有效的孔雀石绿替代药物。
    目前饲料企业对于鱼粉的品控多关注于营养成分，是否掺有非鱼粉物质，新鲜度等问题。很少有企业会想到鱼粉等水生生物来源原料可能含有一定量的孔雀石绿问题，这也是使得一些涉及到出口的养殖企业，被测出产品中含有孔雀石绿时，找不到原因所在。由于孔雀石绿的测定方法中需要使用液相色谱-串联质谱这样的大型分析仪器，大多数饲料企业没有能力配备。而委托检测机构测定的检测费用又很高，饲料企业很难保证批批测定。对于使用国产鱼粉的饲料企业，建议根据实际情况，适当抽检孔雀石绿为宜。

苏老师

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