全球知名虾病专家T.W.Flegel：EHP易被误诊、也不可怕，不要错排了虾苗

可以通过加大换水量、降低放养密度、增强底部排污、控制饲料投喂量等方式来防控EHP

• 文/图 中国水产频道 唐东东

  
  

　　中国水产频道原创独家报道，低养成率使得南美白对虾养殖在中国遭受挑战，尽管成功养殖是一个系统的工程，但业者仍期待有更为优良或更适应中国养殖环境的虾苗出现，以致近几年全球的种虾公司纷纷前往中国这一世界最大的对虾养殖市场淘金。

　　粗略统计，在2016年时就有13家境外的种虾公司进入中国市场。当然，期间不乏企业因虾苗在养殖过程中表现不突出而黯然离场，但淘金者向来并不缺少，仍有种虾公司在不断涌入，泰国顶丰水产养殖有限公司（简称“泰国顶丰”，英文名：TOP AQUA TECHNOLOGY）便是去年的新进者。

　　事实表明，对于中国的虾苗繁育场来说，选择新的种虾来源无疑是在悬崖边跳舞，有可能收获掌声，也可能是一次致命的打击。因此，作为新的种虾品牌要想切入中国市场，被正确了解和评估是前提。为了将种虾的情况展示给中国对虾养殖业者，笔者受泰国顶丰邀请于6月11日起对其进行为期四天的跟进了解。

与Timothy William Flegel教授、 Onchuma Itsathiphaisarn 博士交流现场

　　第一站：泰国国立玛希隆大学Centex Shrimp （泰国国家认证第三方机构）

　　除了水环境的不断恶化之外，逐年增加的病害也是南美白对虾低养成率的主要影响因素，其中未经严格检测的非正关渠道进入的种虾，曾被认为是导致国内对虾养殖新型病害频发的重要原因之一。因此，严格且精准的检测是保证SPF种虾质量的关键环节。据介绍，泰国顶丰一直选择在Centex Shrimp (泰国玛希隆大学对虾分子生物和生物技术实验室)进行譬如EHP、WSSV、EMS、IHHNV、IMNV、ATM等多种对虾特定病原体检测。

　　Centex Shrimp组建于2001年10月，是由玛希隆大学和泰国国家遗传工程与生物技术研究中心（BIOTEC）共同成立的一个多学科实验室，属于泰国官方在对虾领域的权威检测及研究机构，多年来接收全球各地研究机构人员前来交流学习PCR技术。目前有Timothy William Flegel、Kallaya Sritunyalucksana以及Suparat Taengchaiyaphum等3位教授主管项目，主要的研究工作包括：虾类病原体（病毒、细菌和寄生虫）的分子研究、开发用于虾病的诊断探针和试剂盒、研究虾的体液和细胞防御机制、虾基因组分析、虾的营养研究，尤其是提高繁殖能力方面、开发和改良SPF黑虎虾。

　　Timothy William Flegel教授是Centex Shrimp病原体发现和鉴定平台的负责人，也是全球知名的虾类病害研究专家，曾与台湾罗竹芳教授合作研究并公开确定引起对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）的那株特异性副溶血性弧菌的PCR快速检测方法，并公布了检测方法的PCR引物及反应方法。2016年，其参与研究了目前全球灵敏度最高的关于EHP（虾肝肠胞虫）的新型PCR检测方法，能最大程度减少假阳性现象的出现，避免出现误检。

Timothy William Flegel教授和泰国顶丰人员合影

　　EHP于2009 年在泰国生长缓慢的斑节对虾中由Centex Shrimp首次发现分离而命名，实际上自2003年起，泰国斑节对虾的养殖一直受生长缓慢综合征（MSGS）的影响，但一直没有确定病因。2013年，EHP首次在中国被发现，并迅速蔓延成为对虾养殖的主要病害。据了解，EHP侵染对虾肝胰腺部位，但感染后无明显临床症状，往往在养殖30-45天以上才发现生长缓慢、不长个的现象，极易造成饲料损耗，严重影响生产甚至导致亏本。由于早期难以发现，只能依靠PCR分子生物学的方法，去检测对虾组织（主要存在于肝胰腺组织中）、排泄物（粪便）和水体中是否存在EHP来进行预防。

Centex Shrimp工作人员正在提取EHP的DNA（图片来源于Centex Shrimp）

同批次养殖中出现规格差异明显的对虾，抽样来检测对虾肝胰腺中是否存在EHP（图片来源于Centex Shrimp，下同）

　　过去，PCR检测方法是针对EHP核糖体小亚基RNA（SSUrRNA）基因的SSU-PCR方法，但Timothy William Flegel教授所在的研究团队发现，SSU-PCR的引物会与其它的微孢子虫DNA发生交叉反应，导致产生假阳性的检测结果。也就是说，苗场或种虾场可能会因为误诊而不得不把虾苗、种虾直接处理掉，导致遭受不必要的损失。因此，对EHP进行精确诊断显得非常重要。

　　为了克服这个问题，从2011年开始历时五年时间，在2016年一个敏感且特异性强的PCR方法被开发出来。“我们应用巢式PCR避免了假阳性EHP现象的出现，而且针对特定的孢壁蛋白SWP基因进行的新SWP-PCR（Spore wall protein primer，也称SPW-PCR）方法灵敏度更高。”Timothy William Flegel教授表示。相关对比实验数据显示，从感染了EHP的对虾肝脏中提取了25份DNA样品，利用普通PCR做SSU-PCR检测只显示12%的样本呈阳性结果，而用SWP-PCR后显示88%的样品呈阳性。同时，采用普通PCR做SWP-PCR检测时在特定质粒浓度达到104时能检测出来，而SSU-PCR方式需要浓度达到106才可以，意味着前者的灵敏度提高了100倍，但是如果采用巢式PCR，两种检测方式都可以在10个拷贝浓度下就能确定。所以，普通PCR时选择做SWP-PCR检测具有更高的特异性和灵敏度，Timothy William Flegel教授建议可以用其来检测对虾类粪便、饵料及所在水环境中的EHP，而不需要杀死对虾来获取肝胰腺达到确诊的目的。但泰国顶丰声称还是选择用立体随机取样的种虾的肝胰腺来诊断是否感染EHP，以求达到最为准确的结果。

　　此外，Timothy William Flegel教授判断，由于使用SWP-PCR和SSU-PCR检测肝胰腺微孢子虫病（HPM）时显示相同的结果，因此表明只有一种微孢子虫能导致对虾出现HPM。

SPW-PCR （左）与 SSU-PCR （右） 相比，在105浓度下SPW-PCR更灵敏

巢式PCR(下面)与普通PCR（上面）相比，在检测中需要的DNA数量少

SPW-PCR检测孢子虫的结果

检测虾肝胰腺中的孢子虫，放大40倍（A）时看不太明显，将A框区域放大100倍（B）时看得更清楚

EHP卵使用2% 的Phloxine B然后10分钟，卵会染上紫红色

　　Timothy William Flegel教授还认为，即使检测出EHP的存在，也不代表一定要把虾苗排掉，而是可以通过加大换水量、降低放养密度、增强底部排污、控制饲料投喂量等方式来进行控制。据悉，目前泰国通过这些处理方式已经无惧EHP。同时，Timothy William Flegel教授透露，现在正与企业合作研究确定EHP在某个浓度时，是该选择排塘还是能继续养下去。不过，还没有具体结论出来。

　　另外，Centex Shrimp还在研发检测中国对虾养殖中最新出现的虾血细胞虹彩病毒（SHIV）的引物。