赖秋明团队：EMS发病特点及防控

　　南美白对虾“早期死亡综合症”的发病特点及防控
　　
　　苏树叶 赖秋明 陈金玲 柯杨勇
　　
　　海南大学，海南海口，570228

　　
　　中国水产频道独家报道，自2009年以来，南美白对虾“早期死亡综合症”（EarlyMortalitySyndrome）在亚洲地区爆发并蔓延，给亚洲各国的对虾养殖业带来了巨大的经济损失。最近也有学者将该病称为“急性肝胰脏坏死综合症”（AcuteHepatopancreasNecrosisSyndrome）。有关南美白对虾“早期死亡综合症”的研究已有报道，如FlegelT.W.、LightnerD.、EduardoM.Leano等曾报道南美白对虾“早期死亡综合症”的主要发病症状和致病的可能性因素，但对于该病的原发性病原和病因至今尚未有确切的定论。
　　
　　1南美白对虾“早期死亡综合症”的发病特点
　　
　　2010～2012年期间，笔者在海南调研了大量发生“早期死亡综合症”的虾塘并走访了众多的养殖户，通过现场的观察、采样检测及与养殖技术人员的交流，发现不同地区和不同季节发生的“早期死亡综合症”都有许多相同的发病特点。并采集了放养30天左右摄食生长正常的和患“早期死亡综合症”的南美白对虾活体样品。正常组对虾采自海南省文昌市林梧养殖场的6口池塘，患病组对虾采自海南省澄迈县的马村养殖场和南港养殖场的6口池塘。对虾样品通过无菌操作和低温保存，带回实验室分别进行肝胰脏和中肠组织切片、肝胰脏的弧菌和可培养细菌的检测，并采用PCR（聚合酶链式反应）方法检测白斑综合症病毒（WSSV）、桃拉综合症病毒（TSV）和皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）三种特定病毒。现将“早期死亡综合症”的发病特点和相关的实验结果归纳整理如下，旨在为南美白对虾“早期死亡综合症”的防治及流行病学的研究提供参考。
　　
　　1.1对虾“早期死亡综合症”的主要外观症状
　　
　　虾苗放养10-30天为该病的高发期，患病对虾体色呈白浊并微红，多数情况下肝胰脏异常肿大，质地松软，颜色呈淡白或淡黄色；部分患病对虾的肝胰脏明显萎缩，质地变硬（图1）。发病期间，患病对虾通常在池塘水面缓慢游动或趴伏于池塘边坡上，失去食欲，胃、肠充塞度极差，严重者胃肠呈红色。该病病情发展十分迅速，死亡率和排塘率极高，从发现少量病虾到排塘，时间最短的仅2-3天。患病对虾样品经PCR方法检测，通常未被检出携带WSSV、TSV、IHHNV等特定病毒，但肝胰脏和肠组织匀浆经TCBS培养基的培养，均被检测出有大量的弧菌。对虾的发病通常与虾池藻类的老化死亡有密切关系，检测池水的弧菌数量较大，且往往是绿色弧菌占绝对优势。美国亚历桑那大学的Lightner教授在2012年8月的曼谷研讨会上指出，到目前为止，从越南和中国采集的患病对虾样本的组织滤液在人工感染试验中无法证实该病是由病毒引起的，病虾样品的PCR测试结果显示，“早期死亡综合症”与白斑综合症病毒、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒和桃拉综合症病毒没有直接的关系。2013年3月，拜耳（四川）动物保健有限公司的刘涛博士应Chalor教授的邀请前往泰国农业大学参观访问，据Chalor教授介绍，他们的实验中心在一年多前就尝试用病虾作为实验材料开展人工感染试验，甚至用病虾的肝胰脏匀浆滤液注射到健康的对虾，其结果也不能导致健康对虾的发病，认同“早期死亡综合症”不是由病毒引起的观点。
　　

　　
　　图1示患病对虾肝胰脏的肿大和萎缩
　　
　　1.2对虾肝胰脏和中肠的组织学观察
　　
　　通过显微镜观察，发现正常对虾和患病对虾肝胰脏和中肠的组织形态有很大的差异。正常对虾的肝胰脏为复管状腺，由多级分支的肝小管组成，肝小管管壁由单层细胞构成，管腔呈五角或四角星形，腺细胞正常（图2）；中肠管壁组织厚度均匀、致密，肠腔中充满内含物（图4）。患病对虾肝胰脏的腺细胞间隙变大，腺细胞核变小，腺细胞有不同程度的自溶现象，肝小管变形（图3）；中肠肠壁变薄，肠粘膜脱落并散落于肠腔内，肠腔中没有内含物（图5）。
　　

　　
　　图2正常南美白对虾的肝小管横切面

　　图3患病南美白对虾的肝小管横切面
　　

　　
　　图4正常南美白对虾的中肠横切面图

　　5患病南美白对虾的中肠横切面
　　
　　1.3对虾肝胰脏弧菌和可培养细菌的数量
　　
　　通过对生长正常和患病对虾的活体样品体内细菌的检测，发现两者的肝胰脏和肠道均有大量的细菌，但两者细菌的数量和种类有显著的差异。正常组对虾肝胰脏的可培养细菌密度范围为1.59×10⁶～5.83×10⁶cfu·g^-1，平均3.18×10⁶cfu·g^-1；弧菌密度为1.46×10⁵～2.99×10⁵cfu·g^-1，平均1.97×10⁵cfu·g^-1，占可培养细菌的7.64%；在TCBS培养平板上观察，黄色弧菌占绝对优势，密度范围为1.20×10⁵～2.86×10⁵cfu·g^-1；绿色弧菌的密度范围为0.6×10⁴～3.9×10⁴cfu·g^-1，黄色弧菌的密度是绿色弧菌密度的10.25倍，其中的一株黄色弧菌为绝对优势菌株。

　　
　　患病对虾肝胰脏的可培养细菌密度为2.87×10⁶～8.24×10⁷cfu·g^-1，平均2.71×10⁷ cfu·g^-1；弧菌密度为1.28×10⁶～3.59×10⁶cfu·g^-1，平均1.87×10⁶cfu·g^-1，是正常对虾组的9.5倍，弧菌占可培养细菌的15.89%；在TCBS培养平板上观察，绿色弧菌占绝对优势，密度范围为1.02×10⁶～2.97×10⁶cfu·g^-1，平均1.42×10⁶cfu·g^-1，黄色弧菌的密度为0.2×10⁶～0.63×10⁶cfu·g^-1，绿色弧菌密度是黄色弧菌密度的3.16倍，其中的一株绿色弧菌为绝对优势菌株。

　　
　　两株优势菌株均为革兰氏阴性菌，菌体为弯杆状，无芽孢，对弧菌抑制剂O/129均敏感，发酵葡萄糖产酸不产气，生长需NaCl，可利用D-甘露醇，在TCBS平板上分别形成黄色和绿色的圆形菌落，具有弧菌属的典型特征。
　　
　　今年3月，Chalor教授向拜耳（四川）动物保健有限公司的刘涛博士介绍，他们在泰国和其它地区也发现病虾的肝胰脏内有大量的细菌存在。他还向记者透露，Lightner教授最近发现了一些有趣的现象，在越南的一些区域，他们在“早期死亡综合症”病虾体内分离出一些细菌，目前还在研究试验当中，看是否就是这些细菌导致对虾的“早期死亡综合症”。
　　
　　1.4两株弧菌优势菌株对南美白对虾的人工感染
　　
　　我们从患病对虾的肝胰脏分离出一株弧菌优势菌株，在TCBS培养基上其菌斑的颜色呈绿色；正常对虾的弧菌优势菌株则是一株黄色弧菌，在TCBS培养基上其菌斑的颜色呈黄色。在实验室条件下，分别用两株弧菌优势菌株以不同的密度梯度接种到水族箱对健康的南美白对虾幼虾进行人工感染试验。实验结果表明：没有接种任何菌株的对照组的对虾摄食生长正常，实验结束时，水体和对虾肝胰脏内均检出少量的黄色弧菌，但未检出绿色弧菌；在接种绿色弧菌的试验组中，只要水中绿色弧菌的接种密度达到0.5×10⁴cfu·mL^-1时，水族箱的对虾从接种的第3天开始出现死亡，10天内的累计死亡率达到72%；当接种密度为2.5×10⁴cfu·mL^-1时，10天内的累计死亡率达到98%。死亡对虾的外表症状与“早期死亡综合症”基本一致，出现肝胰脏肿大、颜色淡黄、失去食欲、空肠空胃等典型症状，并从死亡幼虾的肝胰脏检测到大量的绿色弧菌和少量的黄色弧菌；在接种黄色弧菌的试验组中，试验期间幼虾摄食生长基本正常，仅有少量幼虾死亡，10天内的累计死亡率为15.5%～22%，死亡幼虾没有“早期死亡综合症”的典型症状，实验结束时，在养殖水体和幼虾的肝胰脏中均检出大量的黄色弧菌，但未检出绿色弧菌。实验结果表明，两株弧菌优势菌株在养殖水体中均可经口感染对虾的消化器官，有很强的感染能力，并可在对虾的消化器官中定植并生长繁殖。通过比较两组对虾的累计死亡率，笔者认为绿色弧菌比黄色弧菌具有更强的毒力。本次人工感染试验是在实验室的条件下进行，由于受光照的限制，养殖水体中没有藻类，说明在没有藻类存在情况下，对虾同样会出现“早期死亡综合症”的症状；本次实验设置的绿色弧菌最小接种密度为5.0×10³cfu·mL^-1，10天内幼虾的累计死亡率达到72%，绿色弧菌在南美白对虾养殖水体中的安全密度应少于5.0×103cfu•mL-1。
　　
　　2“早期死亡综合症”的防控措施
　　
　　南美白对虾“早期死亡综合症”的发生除了与大量的弧菌感染有密切关系之外，也和养殖生态环境差、藻毒素的影响以及对虾自身体质虚弱等诸多因素有关。因此，该病的防控是一项综合系统工程，应同时从改善养殖环境、控制和消除病原和提高对虾自身免疫功能等多方面着手才能收到较理想的效果。经过两年来的生产实践证明，只要方法对头，措施得力，对虾“早期死亡综合症”仍然是可防可控的，许多成功的养殖案例已证实了这一点。
　　
　　2.1定期检测养殖水体中的弧菌密度
　　
　　综合分析其发病的特点，笔者认为“早期死亡综合症”是对虾一种细菌性的消化系统疾病，绿色弧菌的大量感染导致对虾消化道的菌群失衡，危害和损伤对虾的消化器官，使对虾失去食欲并最终导致对虾的大量死亡。在以往发生“早期死亡综合症”的虾池中，养殖水体中通常被检测出有大量的绿色弧菌。建议在虾苗放养前要检查水中弧菌的密度，若水中绿色弧菌密度超过3.0×10² cfu·mL^-1或总弧菌密度超过5.0×10³ cfu·mL^-1，应进行水体消毒和适量施用有益微生物后再放苗；养殖期间每5～7天检测一次，若发现水中弧菌超标，应及时进行水体消毒，24小时后再适量施用有益微生物。
　　
　　2.2培养和维持良好的水色
　　
　　池塘水色是水中单细胞藻类密度和种类组成的综合表现。藻类的光合作用可增加水中的溶解氧，吸收水中无机氮、磷和二氧化碳，对改善水质和促进池塘物质循环起着至关重要的作用。因为以往发生“早期死亡综合症”的池塘通常与“倒藻”有密切关系，所以许多养殖户忽略培藻环节，采取清水放苗，笔者认为这是一种不可取的做法。放苗前的培藻施肥应遵循少量多次的原则，透明度以30～50厘米为宜，水色以黄绿色为佳。养殖期间若发现水色色泽变暗、池水泡沫增多且表层漂浮少量死藻的现象时，说明藻类开始老化，应及时适量的换水，以维持藻类的正常生长，避免“倒藻”现象的发生。
　　
　　2.3维持池塘微生物的多样性和数量的相对稳定
　　
　　在对虾养殖的池塘生态系统中，微生物是不可缺少的生物类群，它们在池塘的物质循环、能量传递和水体净化等方面发挥着极其重要的作用。通常情况下，养殖水体的微生物以好氧微生物为主，它们可以分解和利用水中的有机物，净化水质和底质。在对虾养殖的日常生产管理中，若强力增氧和保持有机碎屑在水中呈悬浮状态，不仅可促进好氧微生物的生长繁殖，强化养殖水体的自净功能，而且可限制其它兼性厌氧微生物的生长繁殖。许多弧菌属的细菌是条件性致病菌，多属于兼性厌氧型微生物，当其在水中密度较大和对虾体质较弱时，容易感染对虾并造成危害。因此，在对虾养殖过程应定期检测池水中的总细菌密度，养殖早期总细菌密度以3.0×10⁴～5.0×10⁴ cfu·mL^-1较为适宜；养殖中、后期随着水中悬浮有机物的增加，总细菌密度会相应增大，以1.0×10⁵～2.0×10⁵ cfu·mL^-1较为理想。许多的成功养殖实例证明，当水中总细菌密度较大时，池塘水质通常比较稳定，对虾的摄食生长也较为正常。另外，保持池塘微生物的物种多样性也极为重要，种类组成越复杂，更利维持总细菌数量的稳定；若微生物的种类过于单一，天气或其它环境因子的突然变化均可能会导致池塘微生物数量的大幅下降。在养殖生产中，许多养殖业者通常采取多种有益微生物制剂的混合使用或交替使用，这对保持池塘微生物的物种多样性和数量的稳定有很好的作用和效果。近年一些养殖业者喜欢采用“老水”养虾，并获得较好的养殖效果。所谓“老水”养虾就是将上一茬养虾效果最佳和水质最为稳定的一池水留下来，等到其它池塘进水准备放养下一茬虾时，再将这池“老水”分别抽到每一口虾池，相当于给每口准备放苗的池塘接入菌种和藻种。“老水”中微生物的种类组成稳定且比较理想，对当地的环境条件具有较强的适应能力，笔者认为这是一种可取的做法。
　　
　　2.4实行科学的投喂管理
　　
　　科学的投喂管理的宗旨是尽量避免饲料的过量投喂。目前许多养殖户担心对虾吃不饱而影响其生长速度，只要看见饵料观察网里没有饲料就在下一餐次加料，而且每一天加料的幅度很大，希望对虾长得更快一些，其实这种做法的结果往往是事与愿违。南美白对虾有贪吃的习性，虽然饲料吃完了，也被消化了，但营养物质并没有完全被对虾所吸收利用，很多的营养物质被当作代谢产物而排到水里，不仅造成饲料的浪费，污染了水质，而且还会加重对虾消化系统的负担，长期如此势必会导致对虾消化器官的功能紊乱。其实这种现象早在2000年海南刚开始养殖南美白对虾的时候就发生过，很多对虾养了20天左右，摄食量开始迅速增加，但经过连续几天的大幅度加料后，对虾的消化系统就开始出现问题，随后池虾的食欲就大幅下降并发病死亡。今年3月，泰国农业大学Chalor教授向拜耳动物保健有限公司的刘涛博士介绍，目前泰国也有类似的情况发生，如果管理方面过于激进，比如放养密度越高，投料越多，就越容易发生“早期死亡综合症”疫情。因此，在确定饲料投喂量时，既要参照饵料观察网的饲料摄食情况，同时还要结合不同生长阶段对虾的现存量、个体规格和相应的日投饵率来计算理论投饵量，以此来修正经验投饵量，尽量避免饲料的过量投喂。
　　
　　2.5优化对虾消化道的菌群组成
　　
　　乳酸菌属于非致病菌，是一类兼性厌氧微生物，它们产生的酸性物质和代谢产物不仅能强化对虾的消化吸收功能，增强食欲和促进生长，而且可抑制对虾消化道弧菌的生长繁殖。最近我们从一些养殖效果较佳、对虾生长情况较好的池塘采集了许多活体对虾样品，发现正常对虾的消化道有大量的乳酸菌存在，其中某些乳酸菌是对虾消化道的优势菌株，可占到消化道总细菌数量的40%。在实验室的弧菌平板培养中，发现这些乳酸菌对绿色弧菌和黄色弧菌都有显著的抑制效果，抑菌圈的大小可与许多抗菌素相媲美。在对虾养殖过程中不定期地使用乳酸菌拌料投喂对虾，将有助于优化对虾消化道的菌群组成，对增强对虾食欲和预防消化道疾病均有很好的效果。