中国水产频道报道，本文从江苏文蛤养殖区发病文蛤和养殖水体中分离到1株优势菌，通过对该菌形态、生理生化特征及致病性进行了初步研究。结果显示该菌株为革兰氏阴性菌，直杆状，生理生化指标为：赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、甘露糖、氧化酶、甲基红阳性，精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、水杨素、V.P阴性。结合形态、生理生化鉴定结果，最后鉴定该菌株为哈氏弧菌。 从药敏试验结果来看，该哈氏弧菌对阿米卡星、复方新诺明、卡那霉素、菌必治、先锋必、链霉素、庆大霉素、新霉素、头孢拉定9种药物高度敏感；对氟哌酸、利福平、头孢噻吩、头孢氨苄、氨苄青霉素5种药物中度敏感；对四环素、青霉素G低度敏感。 文蛤是我国沿海常见的一种重要经济贝类，因其肉质细嫩、营养丰富，深受国内外消费者欢迎，是出口创汇的重要水产品之一。但是近十几年来，随着文蛤养殖规模的逐年扩大，养殖环境恶化导致微生物疾病的流行而引发的养殖文蛤的大规模死亡屡屡发生，已造成巨大的经济损失。而弧菌是导致文蛤发病的主要致病菌，发病的文蛤表现为不能潜入沙中，双壳不能紧闭，壳边缘有许多粘液，消化道内细菌大量繁殖，国内外的报道有副溶血弧菌和弗氏弧菌，郑国兴等发现导致江苏沿岸文蛤大规模死亡的病原菌为溶藻弧菌，而哈氏弧菌作为文蛤病原菌的研究还未见报道。 本研究对发病文蛤优势菌株进行分离、鉴定，并进行人工感染试验和药物敏感性分析，探讨分析导致江苏吕泗文蛤大规模死亡的病原，旨在为文蛤疾病研究提供理论依据，为文蛤健康养殖提供一些参考资料。
材料与方法 1、发病文蛤 于2013年9月份江苏文蛤发病高峰期，采集病状特征明显、濒临死亡的文蛤。患病文蛤（壳长2cm左右）花色暗淡无光泽，表皮部分脱落、表面粘液较少，解剖发现外套膜萎缩，闭壳肌松弛、开合无力，有些发烂发白，软体部消瘦，颜色淡红，血管无色，部分病蛤腮黏液明显增多。 2、组织切片与观察 解剖病贝个体，取部分外套膜（组织块大小为1mm3），样品用Bouin氏液固定3次，然后移入70%酒精中（可放于4℃冰箱保存），梯度乙醇脱水，石蜡浸透与包埋，切片，厚度7-8μm，蜡带经展片剂展开，贴于事先涂有粘片剂的载玻片上，烤片机烘干即可用苏木精和1%伊红染色，最后用乙醇和二甲苯脱色，待玻片上样品稍干燥，用中性树胶封片，NikonＥ600显微镜下观察并拍照，同时固定正常贝外套膜组织作为对照组，以作对比观察。 3、分离方法 无菌盐水洗净，用70%的酒精棉球对体表擦拭消毒，无菌手术刀开启，取肝胰脏等部位无菌匀浆器中匀浆处理，zobell 2216E平板和TCBS平板划线接种，28℃培养24h后，选取优势菌落进行重复划线纯化，纯培养物于4℃冰箱中保存。 4、人工感染试验 人工感染试验在20L水族箱中进行，条件为温度28℃，盐度26.4，pH8.2，连续充气，每组放16只2 cm大小的文蛤。每天换水1次，试验组调节水体中细菌浓度为108cfu/mL，每日投单胞藻1次；对照组不加入菌体，按上述方法饲养；连续观察12d，纪录死亡状况，并进行解剖和病原的再分离以确定是否死于攻毒活菌引起的感染。 5、细菌生化鉴定 按一般细菌常用鉴定方法进行分离菌的生物学性状测定，包括革兰氏染色、形态观察、生理生化特性测定（所用试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司）。 6、药敏试验 采用纸片琼脂扩散法，在zobell 2216E培养基上培养24h，测量抑菌圈直径。药敏纸片（杭州天和微生物试剂有限公司），共19种抗菌药物。 结果与分析 1、外套膜组织病理学变化 健康文蛤的外套膜是由上皮细胞、结缔组织、肌纤维及分泌细胞组成，边缘膜由单层柱状上皮细胞排列而成，中间充满了丰富的结缔组织；边缘膜形成的各皱襞清楚，见图1-1；发病文蛤外套膜发生肿胀，上皮层中杯状细胞增多，部分上皮细胞发生水肿、破裂或萎缩，有的已经脱落，边缘膜突起内及上皮下结缔组织增生，呈杂乱状态；肌纤维细胞排列紊乱，有的已断裂；结缔组织发生空泡变性，组织中血淋巴细胞增多，见图1-2。 2、细菌分离及其形态特征 经分离纯化后，从病蛤中分离到1株优势菌，分离到的菌株均为革兰氏阴性直杆菌（图2-1），菌体直或稍弯，无荚膜，靠鞭毛运动。在TCBS（硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐）琼脂平板上培养18h后，该分离菌株形成黄色扁平的大菌落（图2-2）。 3、人工感染试验 表1显示，该菌株感染病死率为100%。人工感染7d后，文蛤开始出现死亡，9d后全部死亡。于是初步判定2013年9月江苏文蛤大批死亡主要是以该分离菌为主要病原体的传染病所造成。 4、分离菌株生化特性 细菌分离株在40℃以上和4℃以下不生长，无盐不生长，在含8%以上NaCl胨水中不生长，葡萄糖不产气、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、肌醇、水杨素、V.P 阴性，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、甘露糖、氧化酶、甲基红阳性，对弧菌抑制剂O/129（150μg）敏感，这些特性相关文献对哈氏弧菌的描述基本一致，认为分离菌株为哈氏弧菌。 5、药物敏感性试验 利用纸片法测定16种抗菌药物对致病菌的抑制作用，由结果可知，分离株对阿米卡星等9种药物高度敏感，对氟哌酸等5种药物中度敏感，对青霉素产生耐药性。 讨论 哈氏弧菌感染海水养殖动物的报道比较多，但导致贝类病害发生的报道却很少。本次样品采集是在高水温期，表明哈氏弧菌是容易高温环境下生长并导致海水养殖动物的弧菌病，通过人工感染实验可知，感染后的实验文蛤出现明显的病症：花色暗淡无光泽，表皮部分脱落、表面粘液较少，解剖发现外套膜萎缩，闭壳肌松弛、开合无力，有些发烂发白，软体部消瘦，颜色淡红，血管无色，部分病蛤腮黏液明显增多，这与邓欢对扇贝的人工感染实验结果极为相似，死亡率高达100%，从浸泡感染方式发病文蛤处分离到与自然发病相同的细菌，因此可以确定该分离株是文蛤发病的病原体，为文蛤暴发性疾病的预防和控制赢得了宝贵的时间。 从药敏试验结果来看，该哈氏弧菌对阿米卡星、复方新诺明、卡那霉素、菌必治、先锋必、链霉素、庆大霉素、新霉素、头孢拉定9种药物高度敏感；对氟哌酸、利福平、头孢噻吩、头孢氨苄、氨苄青霉素5种药物中度敏感；对四环素、青霉素G低度敏感，因此在疾病发生时可以适量投放一些抗菌性药物。 值得注意的是目前在养殖过程中误用、滥用抗生素和消毒剂等，影响了水体中微生态环境的平衡，可能导致了一些耐药菌株的出现，但是合理选择和使用有效的抗生素仍是目前和近期内控制疾病主要方法。为了更好的预防病害发生，塘养或池养文蛤（滩涂除外）可以适量投放微生态制剂，如：芽孢杆菌和光合细菌，以达到生态防治的目的。 中国水产频道独家报道，转载请说明出处《水产前沿》杂志 www.fishfirst.cn ，违者追究法律责任， 谢谢合作。 【关键字】：养殖 病害 水产养殖 |
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