投喂烟酸诺氟沙星后黄颡鱼肠道内细菌耐药性的变化

　　文/图 华中农业大学 陈昌福、盐城裕达饲料有限公司 陈亮波 郭庆 孟宪东、长江大学动物科学学院 徐展 孙健

　　

　　中国水产频道独家报道：

　　

　　一、材料与方法

　　

　　1、供试药物

　　

　　本次试验中用于投喂黄颡鱼的药物是属于喹诺酮类的烟酸诺氟沙星（Norfloxacin nicotinate），华北制药总厂生产，含量为95.5%，批号：131208。用于测定分离菌株药物感受的药物包括属于喹诺酮类的恩诺沙星（Enrofloxacin），华北制药总厂生产，含量为98.8%，批号：130302。属于酰胺醇类的氟苯尼考（Florfenicol），华北制药总厂生产，含量为98.9%，批号：130208。属于氨基糖苷类的硫酸新霉素（Neomycin Sulfate），宜昌三峡制药有限公司生产，含量为98.0%，批号：130201。属于四环素类的盐酸多西环素（Doxycycline Hcl），是广东华南药业集团有限公司生产，含量为96.8%，批号：130311。

　　

　　2、试验鱼及其饲养条件

　　

　　本研究中的黄颡鱼由盐城裕达水产养殖公司提供。选择健康、活泼无外伤的黄颡鱼作试验鱼。在每个2.0m×2.0m×1.6m的网箱（图1）中饲养50尾平均体重为（22.0±5.0）g的黄颡鱼，每天投喂相当于鱼体重1.5%的人工配合饲料（盐城裕达饲料有限公司生产的黄颡鱼专用配合饲料）。驯养10d，待供试黄颡鱼适应环境，并确认无疾病症状后，开始试验。试验期间池塘中日均换水量约20.0%左右。饲养水温变化幅度为（21±3）℃。

　　

　　3、药物饵料的制备与投喂

　　

　　将烟酸诺氟沙星按25.0mg/kg鱼体重的用药量，将药物首先均匀地拌和在熟化的淀粉糊（图2）中，再均匀地拌合在颗粒饲料中制作成药饵（图3）。添加药物的饵料投喂3个网箱中的黄颡鱼，作为试验组；以未添加药物的饵料喂养1个网箱中的黄颡鱼，作为对照组。每天投喂1次药饵，连续投喂5d。停止投喂药物饵料1d后，从供试鱼消化道中采样。

　　

　　4、细菌分离

　　

　　在投喂药物饵料结束后的第2d，从每个试验和对照网箱中各随机捞取5尾黄颡鱼，在无菌条件下，将供试鱼体用酒精消毒后解剖，从其肠道中采样并接种在铺有脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）的平板上，从每尾鱼消化道中分离的细菌接种3个平板。将接种后的平板置于25℃恒温培养箱中培养48h后，从每尾鱼肠道中接种的3个平板中，共随机挑取10个菌落，从3个试验组黄颡鱼消化道中共分离150个菌株，对照组黄颡鱼消化道中共分离50个菌株。分别转接在BHIA平板中，在25℃恒温培养箱中进行分离菌株的纯培养。培养48h后，用灭菌生理盐水洗下平板中的菌落，并调节细菌浓度为106cfu/mL，冷藏备用。

　　

　　

　　依日本化学疗法学会的方法进行。首先将各种抗菌药物以适宜溶媒溶解后，再用灭菌生理盐水分别稀释至1000.0mg/L的浓度。然后在无菌条件下，用灭菌后的脑心浸液培养基（BHI，Difco）将药物稀释10倍，从而使培养基中药物的浓度达到100.0mg/L的浓度。再用定量移液枪向每支盛有2.9mL BHI培养基的试管中加入2.9mL含有药物的培养基，将试管在混悬器上混合均匀后，从中吸取2.9mL含有药物的BHI培养基加到下一试管中，以此类推制作成药物浓度分别为100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀释药物系列培养基试管。最后，定量吸取0.1mL浓度约为1.2×106cfu/mL活菌液（比浊法测定）加入上述每支试管中，摇匀。置于25℃条件下培养72h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

　　

　　6、最小杀菌浓度（MBC）的测定

　　

　　从各种药物的MIC浓度以及高于MIC浓度的试管中分别取0.1mL培养液，接种于BHIA（Difco）培养基平皿中，置36℃条件下培养5d，没有菌落出现的相应试管中的最低药物浓度，即判为这种药物的最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentrations，MBC）。

　　

　　二、结果

　　1、用药前后菌株MIC的变化

　　

　　从试验和对照黄颡鱼消化道中分离菌株对各种抗菌药物的MIC测定结果如表1所示。由表1可以看出，烟酸诺氟沙星对从对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MIC分别为0.78-6.25μg/mL，从连续投喂5d烟酸诺氟沙星药物饵料后的黄颡鱼消化道中分离的150个菌株，其MIC上升至3.13-50.0μg/mL。对属于同一类的恩诺沙星，对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MIC为0.39-12.5μg/mL，而对从试验组黄颡鱼消化道中分离的150个菌株的MIC上升1.56-50.0μg/mL。硫酸新霉素、盐酸多西环素和恩诺沙星等3种抗菌药物，无论是对从试验还是对照组黄颡鱼消化道中分离菌株的MIC均没有明显变化。

　　

　　2、用药前后菌株MBC的变化

　　

　　从试验和对照黄颡鱼消化道中分离菌株对各种抗菌药物的MBC测定结果如表2所示。

　　

　　由表2可以看出，烟酸诺氟沙星对从对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MBC分别为3.13-12.5μg/mL，从连续投喂5d烟酸诺氟沙星药物饵料后的黄颡鱼消化道中分离的150个菌株，其MBC上升至6.25-25.0μg/mL。对属于同一类的恩诺沙星，对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MBC为1.56-12.5μg/mL，而对从试验组黄颡鱼消化道中分离的150个菌株的MBC上升1.56-25.0μg/mL。氟苯尼考对试验和对照黄颡鱼消化道中分离菌株的MBC均为0.39-3.13μg/mL；硫酸新霉素的MBC为3.13-25.0μg/mL；盐酸多西环素的MBC均为6.25-50.0μg/mL。即无论是对从试验还是对照组黄颡鱼消化道中分离菌株的MBC均没有明显变化。

　　

　　

　　已经有大量的研究结果证明，对鱼类使用抗菌素与对其他动植物使用抗菌素一样，容易导致致病菌产生耐药性。本研究中经过连续5d给黄颡鱼投喂烟酸诺氟沙星药物饵料后，从试验鱼消化道中分离的菌株，至少是大部分菌株已经对该药物的耐药性明显增强。说明给鱼类投喂烟酸诺氟沙星容易导致养殖鱼类消化道内的细菌产生耐药性。

　　

　　细菌对不同抗菌素的敏感性是不同的，在本研究中的5种抗菌素中，从对照黄颡鱼消化道中分离的菌株对氟苯尼考、硫酸新霉素均比较敏感，对烟酸诺氟沙星、恩诺沙星和盐酸多西环素的敏感程度比较低。这可能是养殖业者以往预防和治疗黄颡鱼疾病过程中，使用这些药物比较多的缘故。

　　

　　值得注意的是，给供试黄颡鱼投喂烟酸诺氟沙星药物饵料后，黄颡鱼消化道中的细菌不仅对烟酸诺氟沙星的耐药性有所上升，而且同属于喹诺酮类抗菌药物的恩诺沙星的耐药性也相应上升了，即烟酸诺氟沙星与恩诺沙星之间显示出了明显地交叉耐药性。而测定结果也证明了分离菌株对属于氨基糖苷类的硫酸新霉素、属于四环素类的盐酸多西环素和属于酰胺醇类氟苯尼考，均未出现明显交叉耐药性的现象。

　　

　　需要说明的是，本研究中未对分离菌株做种类鉴定，而对抗菌药物的敏感性是与细菌的种类相关的。试验与对照组中各种细菌种类的差异，以及因为种类差异导致的对药物敏感性测定结果的影响，尚需要进一步研究。（由江苏省水产三新工程项目（编号：D2013-5-1）资助，参考文献略）

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