文/图 广州利洋水产科技股份有限公司 谭鲜英 张文文 戚瑞荣 烟台大学陈营 在笔者团队的检测中，共发现6个PirAB型副溶血弧菌的分离菌株对所有试验药物产品均不敏感，即俗称的超级细菌。虽然出现的数量少，但在对虾疾病的防治中应给予足够的重视，否则一旦发病或蔓延扩散，将没有抗生素类产品可用 利洋公司自2014年开始进行对虾致病性副溶血弧菌的流行病学调查、病原菌的分离、PirAB毒素基因的PCR检测、毒力菌株的药敏试验等，为对虾的养殖生产实践提供了科学的理论指导。在我们的检测中，共发现6个PirAB-Vp分离菌株对所有试验药物产品均不敏感，即我们俗称的超级细菌。虽然出现的数量少，但在对虾疾病的防治中应给予足够的重视，否则一旦发病或蔓延扩散，将没有抗生素类产品可用。 一、材料和方法 1、病虾和水样的采集 在养殖南美白对虾发病时，采集病虾的肝胰腺的和水样，接种TCBS平板。然后，送利洋公司研究所进行PirA毒素基因的PCR检测，并对阳性菌株做药敏试验分析。 2、病虾和水体的PirAB-Vp检测 挑取TCBS平板上的单菌落或转接的过夜培养物，煮沸制备细菌基因组模板，采用PCR方法进行副溶血弧菌和PirA毒素基因的检测。 3、药敏试验 对经过PCR检测阳性的PirAB-Vp菌株，采用纸片法进行药敏试验，通过测量滤纸片周围出现的抑菌圈的大小，衡量其对所试药物的敏感程度。所试药物为公司的9种抗生素类产品，通过实验确定适当的药物浓度并自行制备药敏纸片，抑菌圈直径d≦14mm即为不敏感或耐药。 二、结果 1、对虾PirAB-Vp菌株中水产超级细菌的发现 今年二季度，从对虾肝胰腺和养殖水体中共检出261株PirAB-Vp，对其中的108株分离菌进行了药敏试验分析，共发现6株菌对全部所试药物（产品）不敏感或耐药，表现为完全的耐药性，见表1。对虾PirAB-Vp分离菌株对常用的水产药物均耐药，呈现水产超级细菌的特征。在抑菌圈里生长的稀疏菌落，是典型耐药菌株的表现，见图1a。而同时从采集的样本中分离的对照菌株，在药敏试验中出现清晰的抑菌圈，见图1b。 2、对虾PirAB-Vp毒力与耐药性之间的关系 在江苏、海南、广东三个地区的PirAB-Vp分离菌株中，均发现超级耐药的水产副溶血弧菌，而且肝胰腺和水体都有超级耐药菌株分离。经pirA毒素基因检测，本文中6株全部耐药的菌株均为携带PirAB毒素基因的副溶血弧菌，即PirAB-Vp菌株。在二季度我们共检出261株PirAB-Vp，同时也检出45株携带PirAB毒素基因的非副溶血弧菌。但未在PirAB非副溶血弧菌和不携带PirAB毒素基因的对虾弧菌中发现全部耐药的超级细菌，见表2。 三、讨论 1、对虾PirAB副溶血弧菌超级细菌出现的意义 对虾致病性副溶血弧菌是一个特殊的菌株，完全不同于从临床上和环境中分离的菌株，相关的药敏试验分析报道很少。在的日常检测中，我们发现了6株对多种水产常用抗生素完全耐药的PirAB-Vp菌株，即水产超级细菌。如果这样的菌株引起对虾发病或在水产养殖系统中大量繁殖，将没有可用的药物去控制和治疗。虽然发现超级细菌的数量少，但涵盖广东、海南、江苏三个地区，这样生态上的广范分布，可能会预示今后其出现的几率更大、范围更广，随之带来的生物安保防控问题也会加大。提示我们在今后对虾疾病的防控中，要注意内外兼顾，科学施治，切断病原菌流行和传播的途径，控制疾病的发生和发展。 2、对虾PirAB副溶血弧菌耐药性产生的机制 细菌的耐药性多由质粒携带，在环境不利条件胁迫时，耐药质粒在群体间加速转移，使得耐药菌株被选择出来而成为群落中的优势种群。而多个耐药质粒或基因同时出现在一个菌株的细胞内，这可能是出现超级细菌的主要原因。其次，因为每种药物的杀菌机制及菌株的耐药机制均不相同，同时出现对所有药物耐药的几率极低。但如果细菌的某些通用机制发生改变，如细菌细胞膜上负责转运药物的外排通道开启，使得药物不能进入细胞内发挥作用，会造成对所有试验药物均不敏感，这个机制更有可能是超级细菌出现的原因。 关于耐药菌株的来源，目前还不清楚。推断池塘底泥中、附着物上、水生生物体内都可能是耐药菌株的来源，进而通过水体、附着物、水生生物传播，造成超级细菌的流行和扩散。 3、对虾PirAB副溶血弧菌毒力与耐药性之间的关系 毒力和耐药的出现往往具有相关性，两者多由质粒携带，受环境压力的胁迫，质粒在细菌群落中出现转移，带有毒力的菌株往往同时带有耐药性，使其在生态系统中具有竞争的优势，更容易侵入宿主体内而致病。最新的研究证实，PirAB-Vp携带一个约69kb的大质粒，在质粒上有两个与昆虫致病相关的毒素基因PirA和PirB，它们分别编码一个13kDa和50kDa的外毒素蛋白并分泌到周围环境中。我们的检测发现，完全耐药菌株只在PirAB-Vp中出现，未在PirAB非副溶血弧菌和不携带pirAB毒素基因的弧菌中发现。虽然，对虾PirAB-Vp中出现超级细菌的机制尚不能明确。但是，可以确定PirAB-Vp中出现多种耐药的超级细菌与其携带的毒力基因大质粒有一定的相关性。而且，两者之间是否存在必然的联系值得进一步研究。  【关键字】：PirAB型 副溶血弧菌 超级细菌 对虾 养殖业 灾难 水产养殖 |
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