鱼类肠道正常菌群研究进展

那头，人已远

鱼类肠道正常菌群研究进展

宋增福 1，吴天星2

(1.上海水产大学生命学院，上海 200090；2.浙江大学化学系，浙江 杭州 310027)

关键词：鱼；肠道；正常菌群

作者简介：宋增福(1971-)，男，博士

研究方向：水产微生态与疾病防治；E-mail：zfsong@shfu.edu.cn.

通讯作者：吴天星(1963-)，男，教授，博士生导师

研究方向：动物营养学与饲料科学；E-mail:wutx@tianbang.com

    鱼类肠道正常菌群是肠道的正常组成部分；是肠道微生物与宿主以及所处的水生环境形成的相互依赖、相互制约的微生态系；对营养物质的消化吸收、免疫反应以及器官的发育等方面具有其他因素不可替代的作用，并且影响到鱼类的生长、发育、生理和病理。笔者拟就鱼类肠道菌群的形成、结构与数量、生理功能以及影响菌群结构的因素、与益生菌的关系等方面加以综述。

1 鱼肠道正常菌群的形成

    研究表明细菌最初的定植过程在幼鱼发育阶段是非常复杂的，通常受到多种因素的影响，但主要是决定于鱼卵表面、活的饵料和幼鱼饲养水体中的细菌[122]。处于孵化阶段的幼鱼具有一个发育不完全的消化道，其内是无菌的。处于孵化过程中的幼鱼主要依靠卵黄来供给营养物质，当其从卵中孵化出来，一旦接触到周围的水生环境和活饵料，多种细菌就开始在肠道上皮定植[327]。Mroga等[6]研究发现肠道菌群的主要来源是所摄取的活饲料而不是养殖水体。另有结果表明，最先定植的细菌能调节上皮细胞的基因表达，从而使最先定植的细菌与宿主肠道环境相适应，并且可以阻止在这个生态系统中后来的细菌的定植。因此，最初的细菌定植与成年最终稳定的肠道菌群组成结构具有高度相关性。然而，也有的试验结果表明肠道的菌群与鱼的饲料和水体环境中的细菌并不相同[8]。

2 鱼类肠道菌群的特性、组成及数量

     鱼类肠道菌群细菌种类繁多，数量极大。有研究报道指出，淡水鱼肠内细菌的数量基本为105～108[9]，而海水鱼肠内细菌的数量106～108[10]。肠道的优势细菌为革兰氏阴性菌，同时也存在革兰氏阳性菌[11]。

      由于鱼类的生存生长环境与陆生动物不同，因此，在肠道微生态系中其细菌的某些生理生化特征也表现出特异性。Smith对鱼的肠道的大肠杆菌进行研究时就发现,鱼肠道的大肠杆菌可以液化明胶，不产生吲哚，而这些特性是从陆生动物肠道分离的大肠杆菌所不具备的。

    不同种类的鱼之间,由于所处的水体环境、食性等因素，其肠道细菌组成和结构也不尽相同的。研究表明淡水鱼类肠道内专性厌氧菌以A、B型拟杆菌科等为主[11212]，好氧和兼性厌氧细菌则以气单胞菌属、肠杆菌科等为主[9]。乳酸菌在陆生动物是常驻菌，而在鱼类也是肠道菌群的组成部分。Ring等[13219]曾对乳酸菌进行了系统研究。王红宁[20]对淡水养殖池中的鲤鱼肠道的菌群结构研究发现，在鲤鱼肠道中的需氧和兼行性厌氧菌的数量依次为：气单胞菌、酵母菌、大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌、需氧芽孢杆菌。气单胞菌和酵母菌的数量更多。可以认为是肠道里的优势需氧、兼性厌氧菌。厌氧菌的数量依次是：拟杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌，其中拟杆菌数量最多，可以认为是肠道中的优势厌氧菌。尹军霞等[21]对淡水养殖池中的4种不同食性鱼—乌鳢、鲢、鳊、鲫的肠道壁菌群进行了定性、定量分析，发现不论是好氧菌还是厌氧菌，同种鱼前肠壁分布一般比中肠壁和后肠壁少；同一肠段相比,都是厌氧菌总数远大于好氧菌总数，一般相差2～3个数量级；不同鱼种之间，肠壁的好氧菌总数差别比厌氧菌总数差别大得多；厌氧菌中的乳酸球菌和双歧杆菌具有一定的正相关性。4种鱼肠道壁中的厌氧菌总数和双歧杆菌分布的规律是：肉食性的乌鳢>杂食性和广食性的鲫>食浮游植物为主的鲢>草食性的鳊，即鱼类肠道壁中的厌氧菌总数和双歧杆菌随着从草食性向肉食性发展而逐渐增加。Rachel等[22]从淡水扁鲨和Oscars以及南方比目鱼中分离到梭菌、革兰氏阴性菌属的梭菌、拟杆菌等细菌。因此，鱼类肠道的菌群组成结构随着鱼种类、食性、生长的环境的不同而呈现出差异。

3 鱼类肠道正常菌群的生理功能

    肠道正常菌群在鱼类的生长发育过程中担当非常重要的作用，它既要参与营养物质的消化和吸收，同时又要担当机体的防御功能，维护机体的健康。

3.1 营养功能

    根据微生态的三流运转理论，微生态系统中存在能源流动、物质交换和基因传递。动物、人类及植物的组织细胞与正常微生物之间以及正常微生物与正常微生物之间都存在着能源的交换。电镜观察发现肠上皮细胞表面的微绒毛与菌体细胞壁上的菌毛极为贴近，并有物质交换的迹象。

      在鱼类肠道微生态环境中，正常菌群的建立通常被认为是对动物发育不完全肠道酶系的有益补充，尤其是在幼鱼发育阶段。它能合成分泌一些天然食物中不含有而宿主生长发育所必需的维生素、酶、调节因子等，且能分解产生一些易被宿主吸收的物质供宿主吸收。同时，正常菌群及其某些新陈代谢产物能促进宿主对某些营养物质的吸收，改变宿主消化酶的活性，从而对宿主的新陈代谢起着不可缺少的影响作用。Sugita等[23]从罗非鱼和鲶鱼肠道里分离出具有产生维生素B12的细菌。早期对胭脂鱼的研究表明，从肠道内分离的弧菌和肠道菌具有分泌蛋白酶、淀粉酶、几丁质酶和卵磷脂酶的能力[24]。Das等[25]研究草鱼消化酶时，为校正肠道细菌分泌的酶所引起的误差，用抗菌素饲喂草鱼，然后比较试验组与对照组鱼肠道狡甲基纤维素分解菌，发现肠道细菌的纤维素酶对草鱼消化食物中的纤维素起了一定的促进作用。Sugita等[26]分析了香鱼、日本鳗鲡、鲤、罗非鱼、斑点叉尾鲴回等淡水鱼类肠道菌群的产酶能力，认为肠道菌群在淡水鱼的淀粉消化中占有重要的地位。潘康成等[27]利用2种有益地衣芽孢杆菌，饲喂鲤鱼，对鲤鱼的生长有明显地促进作用和显著提高鲤鱼肠道消化酶的活性。Bachel等[22]分析了淡水扁鲨、Oscars和南方比目鱼的肠道厌氧菌的产酶功能，发现这些肠道的厌氧菌可以产生酸性和碱性磷酸酶、四碳和八碳的酯酶、十四碳的脂肪酶、芳基化合物分解酶和糖苷酶等。Schrijiver[28]研究发现，当日粮中添加解蛋白弧菌时，解蛋白弧菌会提高表观氮消化率(P<0.01)。由此可见,肠道菌群分泌的蛋白酶、淀粉酶等消化酶可以辅助鱼类营养物质的消化，包括一些难以分解的纤维素等物质，从而促进营养物质的转化和吸收；产生的维生素等营养物质可以弥补饲料中营养物质的不足。这就为外源益生菌的添加会促进鱼的生长提供了科学依据。

3.2 防御功能

      正常微生物群覆盖在肠道黏膜的表面作为物理屏障可以拮抗致病菌的入侵；同时可以刺激机体产生非特异性和特异性免疫反应从而加强机体的保护作用。这种防御机制主要包括定植阻抗、病原菌抑制和免疫调节作用。

3.2.1 定植阻抗

      在动物肠道中，正常菌群其厌氧菌占99%，它们是构成动物肠道屏障之一。定植阻抗是指肠道菌群具有排斥病原菌在肠道上皮细胞定植的作用，也可以形象地理解为肠道菌群就像栅栏一样起到了阻拦病原菌的作用。动物模型试验在这方面提供了有力的证据。20世纪60年代的小鼠沙门氏菌感染试验最具有说服力。试验结果表明，无菌鼠的沙门氏菌致死量只有普通鼠的十亿分之一。由此可见，肠道菌群的屏障保护作用非常显著。Bergh[29]指出,鱼类的体表和消化道黏膜内定居着共生性细菌，他们形成菌丛，从而成为防止病原菌定居和增殖的屏障。

3.2.2 病原菌抑制

      试验证明，在从鱼肠道里分离的部分细菌具有抑菌的作用，可以保护宿主免受病原菌的侵害。Sugita等[26]对从鱼类的肠道菌群中分离出304株细菌进行抗菌的试验研究发现，3.23%表现出抗菌的能力，尤其是嗜水单胞菌、假单胞菌、梭状芽孢杆菌的几个菌株可以抑制7～12个靶菌株。在此基础上的抗菌效果显示,抗菌活力随鱼的种类、采样时间、部位而有差别，同时这些抗菌物质对肠道菌群的组成也有影响。Olsson[30]用鳗弧菌饲喂大菱鲆，发现肠道肉杆菌可以抑制鳗弧菌的生长。

3.2.3 免疫调节

    鱼类免疫反应是一种极为复杂的生理现象，受很多环境因素的影响。鱼类在进行自身免疫保护时，主要行使非特异性(先天性)与特异性(获得性)两大免疫防御功能。 李莉[31]研究发现，随着肠道内气单胞菌(Aeromonas)百分含量的下降，肠拟杆菌(Enterobacteriaceae)百分含量的上升，草鱼白细胞的吞噬百分比和吞噬指数明显上升，这说明草鱼肠道优势菌群气单胞菌、肠拟杆菌的变化可能与白细胞吞噬活性增强有关。Panigrahi[32发现，虹鳟鱼饲喂乳酸菌(LactobacillusrhamnosusJCM)时，活的乳酸菌比热致死的乳酸菌能够更好地诱导巨噬细胞的吞噬活性和补体功能，并且使血浆免疫球蛋白水平呈现增加趋势。因此，鱼类肠道菌群的变化或者外来益生菌的添加均会引起机体的免疫反应，但是他们之间内在的关系尚不清楚，还有待于更多的试验探讨。

4 影响鱼肠道菌群结构与组成的因素

      动物微生态系统是由动物、微生物和环境彼此相互作用、相互依赖的统一整体，这个整体是由不同层次、不同环节相互联结成的立体交叉网络，这个网络就是微生态系统的多维空间结构。作为鱼的肠道微生物菌群，由于所处的宿主的肠道生长环境是和周围的水体环境紧密相关，形成一个整体，其平衡更容易受到外界水体环境变化、饵料的变换等因素的影响，尤其是在幼苗时期。Cahill[33]曾就众多的试验结果总结认为，水环境中的细菌影响肠道微生物的菌群结构，同时肠道的菌群结构也影响水体环境的微生物结构，肠道里的微生物是那些和环境中的微生物相同的种类或者是那些在日粮中存在的并且能在肠道繁殖的微生物。Ring等[14]曾对肠道的乳酸菌进行了细致的研究，发现不饱和脂肪酸、营养竞争、三氧化二铬、盐度和应激等因素都会对肠道的乳酸菌产生影响。因此，与鱼直接接触的水体环境对鱼肠道微生物菌群的影响要远远大于陆生动物和人所处的外部环境对肠道微生物菌群的作用。

      鱼类是变温动物，消化道的微生物也会随体温的变化而发生变化。曾勇等[34]研究了草鱼肠道中气单胞菌的季节变化。在冬季停食阶段，前肠壁的气单胞菌的占总菌数比例明显升高。Janina等[35]研究发现，在3月未检测到比目鱼肠道的菌群，而在夏天检测到细菌数为14.5×106。

      饲料的组成能改善鱼消化道微生物菌群的结构。曹志华等[36]的研究发现，饲喂鲤鱼含有尿素的饲料，对照组肠道中的优势菌为气单胞菌、芽孢杆菌、葡萄球菌和微球菌，可利用尿素的细菌占细菌总数的55%。试验组的优势菌为芽孢杆菌,肠杆菌和葡萄球菌，可利用尿素的细菌占85%。陈孝煊[37]的研究发现，饱食状态下草鱼的肠道菌的平均为8.7×107cfu/g，空肠状态下为7.29×106cfu/g,差异显著。

    在正常生理条件下，肠道正常的菌群会发生变化；在病理条件下，肠道菌群的变化往往是病因或结果。在发病的时候，条件致病菌大量繁殖，会导致肠道菌群的平衡失调，进而导致整个病情的恶化。蒋长苗等[38]研究了草鱼肠道正常菌群与肠炎病原菌间的关系，发现发生肠炎的草鱼，点状产气单胞菌、大肠杆菌、肠球菌显著增加，而乳酸杆菌、双歧杆菌数量减少，厌氧菌与需氧菌比值显著下降。从微生态学的角度认为，以厌氧菌显著下降为特征的菌群失调是草鱼肠炎的发病机制之一。

5 研究鱼类肠道菌群试验动物模型和方法

      对鱼肠道正常菌群的研究常用和有效的方法是传统的细菌纯培养的方法，但是该方法常规培养的肠道细菌的种类有限，而且此方法工作量大，分析数据不够准确。随着分子生物学的迅速发展，将为鱼肠道的菌群分析提供了有力的技术支撑。

5.1 新型试验动物模型的建立为研究鱼的肠道的细菌提供了有利的工具

      无菌动物在肠道的细菌研究中发挥着重要的作用，尤其是在陆生动物研究方面。目前大多数的有关肠道菌群的知识是通过无菌动物的研究获得的。但是在鱼类肠道的研究方面，由于没有无菌鱼，因此在研究时就显得有些力不从心，所以很多的相关知识是从陆生无菌动物的研究中借鉴而来的。无菌鱼的出现使得这种状况得以改变。

5.2 分子生物学的方法为研究鱼的肠道正常菌群开辟了新的途径

    用分子生物学方法研究人和动物的肠道菌群早已得到应用。而在鱼类的肠道菌群研究方面，这些方法应用比较少，如核酸探针、原位杂交，变性梯度电泳等。但是这将为鱼类肠道正常菌群的研究开辟新的途径。

6 益生菌对鱼类肠道菌群的调控

      鱼类的肠道微生物区系在鱼的健康方面扮演非常重要的角色。肠道的微生物区系的动态平衡是动物保持个体健康和发挥正常生产性能所必需的条件，调控鱼类消化道微生物区系对提高鱼类的生产性能和饲料利用率，减少病原菌在肠道内的定植具有重要的意义。益生菌调控肠道微生物区系的作用已越来越受到人们的重视。王红宁[20]研究了微生态添加剂饲喂鲤鱼肠道内的7种菌群(气单胞菌、大肠杆菌、需氧芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和拟杆菌)并对这些菌群进行了定量和定性分析，结果表明试验组的大肠杆菌数显著<对照组，试验组的气单胞菌、需氧芽孢杆菌、酵母菌、双歧杆菌和拟杆菌有所增多，但是与对照组无显著差异，而乳酸杆菌略有减少。可见微生物添加剂有显著抑制鲤鱼肠道大肠杆菌的作用，并使肠道内的微生物数量通过其他微生物(有益微生物的添加)而达到新的平衡状态。

    鱼类肠道菌群的平衡是鱼肠道发挥正常生理作用的外在基础，因此，积极研究和探讨鱼类肠道的微生态并加以调控，使之建立稳定平衡的菌群体系，对维护鱼类的健康，提高鱼的产量，生产安全的水产品，具有积极的理论和实践意义。益生菌作为调整肠道菌群平衡的活菌制剂，必将会在水产业中发挥积极的作用。

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