【在线交流】台湾石斑鱼疫苗研发之路@台湾国立成功大学杨惠郎教授与网友在线交流

水宝宝

一、 前言

1. 台湾一向足以为傲、领先国际的水产养殖产业，一再发生疫病，产业面临衰萎危机

台湾及亚洲的水产养殖尚停留于传统家庭式(backyard) 小农模式，素喜密集养殖，水中鱼多、排泄物多、细菌就多，鱼只受到紧迫(stress)，抗病力降低，造成严重病情及高死亡率。

疾病在台湾已使多种重大水产养殖主要品种逐项沦陷。例如

 1987年，台湾号称草虾王国年产量高达80,000吨，短短不到三年、自1990年开始草虾感染白点病病毒(WSSV)而养殖失败，产业一去不复返。

 同样的白点病病毒病情在国际间也一再发生。例如白点病病毒在亚洲于1992年造成近美元4-6 billion之损失，不久在1999年白点病病毒猖獗中南美洲、也造成近1 billion美元送损失。

 养殖户于是开始改养具白点病病毒高抗病力的新虾种-白虾，同样地白虾的桃拉(Taura)病毒，也很快地在1991-19921出现，造成近2 billion美元的损失。现在WSSV及Taura病毒是国际养虾产业天天得面对的恶梦。

 在1990年代，一些台湾养虾户也开始养贝类九孔或鱼类石斑及海鲡。九孔近年来也深受不明病原侵犯，产业在台湾已消失。

 改养鱼类之养殖方向、备受看好的石斑，台湾曾是为国际石斑鱼苗供应中心，曾占有国际80%的石斑鱼苗市场。近年来也受脑神经坏死病病毒(NNV, Nervous Necrosis Virus)感染，大部份石斑种鱼及受精卵都带病源，导致鱼苗育成的成功再现率不到10%；

 在成鱼育成上、海鲡及石斑由鱼苗成鱼育成率只约为20-40%。当然疾病问题也是国际水产养殖之共同问题，例如在2008年智利鲑鱼养殖发生大规模ISA (infectious salmon anemia) 感染，造成正急速成长之鲑鱼养殖产业损失近20亿美元。

不同鱼、虾、贝类养殖产业同样地受一直不停地受病害感染，养殖户不停研发改养新品种，也一再失败、重蹈覆辙。在养殖模式若不改进的情况，各种水产之养殖产业一蹶不振的历史必将一再重演，这些疾病造成的产业困境，已使养殖业者一筹莫展。

密集养殖不只造成疾病，使养殖户饱受损失；而为治疗疾病、必需大量使用抗生素，导致鱼货的药物残留，消费者对鱼货质量的要求日严，药物残留使消费者怯步不前；养殖环境中抗药性细菌之发生，抗生素逐渐失效，因而不得不加重剂量，再造成抗生素药物滥用，抗药性细菌之积存，更延伸造成养殖环境之破坏及产业衰微等后果。这由密集养殖到疾病，导致环境恶化及鱼货质量下降，环环相扣的因果循环，也就是传统式养殖产业发展的瓶颈。

水产养殖产业发展历史就有如陈李农改研究团队执行长杜宇及海洋大学水产养殖系教授郭金泉叙述「台湾水产养殖发展，始终落入不断追求明星物种的迷思」，把「落跑当转进」，遇到问题不澈底解决，而改养新鱼种，是现在养殖渔业政策最大盲点。在疾病无国际的现况下，目前传统水产养殖产业之发展困境已是台湾也是国际水产养殖产业急待解决之瓶颈。

回顾人类及动物之医学史，在疾病之控制、预防重于治疗，在医药之使用的成功经验上、预防疫苗功能更胜于治疗抗生素之使用。在水产动物之疾病控制上、当前欧美水产养殖产业之冷水鱼种鲑鱼养殖已全面成功地使用疫苗提升饲养成功率。台湾及其他开发中国家现有的家庭式(backyard)经营的暖水鱼种之养殖则尚未使用疫苗来解决疾病传染。海水水产养殖已被国际重视，工业化之水产养殖也是国际各海洋国家积极建立水产养殖产业的理想目标。

2、石斑养殖业面临疾病危机，石斑王国前途堪忧

石斑(俗称朱过鱼、郭鱼)鱼肉质鲜美，是华人最喜欢的高价桌鱼。石斑鱼栖息于珊瑚礁的底栖鱼类，不易以鱼网捕捉，通常需以钓竿、鱼枪、炸药或毒药麻醉捕取。这种捕鱼法也造成珊瑚礁生态的破坏。过度捕捞也使多种石斑濒临绝种，如赤点石斑鱼，鞍带石斑鱼(龙胆石斑)皆已分列为”频危”或”易危”品种。亡羊补牢应以养殖取代捕捞。最近石斑也在ECFA上被列入早收清单，市场极富潜力，养殖户颇为兴奋。因此在经济上、食用上、生态维护上，石斑为一台湾值得投入养殖的鱼种。

石斑鱼苗繁养殖最主要的病原为NNV病毒，成鱼育成阶段则为细菌性疾病为主。NNV是一种非常简单的RNA病毒，只感染鱼类，尤其在鱼苗阶段最为严重。NNV也感染鲈鱼、比目鱼、海鲡等重要鱼种，更严重的是台湾最普偏的青斑及龙胆石斑在胚胎期之鱼苗就会受感染，在孵化后14至50天最常见疾病发生，在龙胆石斑50天后之稚鱼至成鱼阶段则也见病毒感染。而稚鱼期一旦感染常达100%致死率，被认为是国际高价鱼种养殖最严重的疾病之一。因为一般石斑养殖户缺乏疾病控制的观念，一有病毒感染、育苗失败，就直接排放未经处理的养殖用水，因此也将大量的病毒传播，感染更多鱼只并污染环境。我们多年来以最敏感之检测方法(RT-PCR)调查台湾石斑生产区NNV病毒流行状况，发现南部石斑养殖之环境已完全被病毒污染，因此、在台湾石斑养殖区可说已是偏地病毒，传统Mesocosm方式生产石斑鱼苗之过程中有多重不同途径病毒可趁隙而入。例如检测之近百尾种鱼中带病原，生产之受精卵近90%也发现带病毒，可由垂直方式感染鱼苗；更严重的是石斑鱼苗必需之初期饵料-坊间之桡脚类浮游生物也可能因养殖土池之污染大多也带病毒，在育苗的不同阶段感染鱼苗。而坊间之一般鱼苗场尚无严格的安全隔离观念(Bio-security)及设施，也会因育苗池内部及工作人员及访客外人携入；在众毒”围城”之下当然无一幸免、一一沦陷。

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二、 成功大学组合研究团队投入石斑生物科技之研究

在高科技的现代，危机就是转机，转机创造商机。现代养殖生产户必需同时维护生产环境及保持产品质量。因此民生养殖产业已逐渐走向资及量必需兼顾的绿色生产模式。绿色有机养殖业，需利用科技，预防疾病，精致管理，建立生产履历，发展对环境友善，生产优质产品，负责的生产方式。才能建立可永续经营的养殖科技。

成功大学地处台湾南部石斑养殖区，为协助产业，我自2001年由中央研究院转任国立成功大学，就组合水产生技医药研发团队。团队迄今已有5位助理教授以上研究人员，加上研究助理及研究生共约四十多位研发人员，为一具国际规模之水产养殖生技研究团队。研究专长涵盖鱼病，疫苗研发及测试，鱼免疫学，鱼与病毒交互机制，胚胎发育之营养需求及藻源医药成份，虾免疫学，养殖紧迫分子机制。实验设施在校方支持下，在成功校区已有近200坪之分子生物、病理、微生物、免疫、病毒之实验室，在安南校区现有100L及500L细菌酦酵糟供疫苗及免疫促进剂之生产，并建构近250坪之水产实验设施，供疫苗测试使用。其中最特殊的是一国际首座的室内式无病毒(SPF)石斑鱼苗孵化育成场，及室内式无病毒(SPF)初期饵料生产设施，已可长期稳定地生产无病毒石斑鱼苗供实验用。团队的愿景以研发生物科技协助石斑养殖产业科技化(精致农业) ，由关键产品之研发，到系统整合。在生产质量链(Quality chain)的工业化养殖的观念下，发展能澈底解决传统式水产养殖产业危机，建立成科技化养殖产业的创新科技，并选择石斑为目标产业。

团队研究主轴为暖水鱼种相关之生技医药的基础及应用研究。并选择高经济价值的海水鱼种，如海鲡与石斑作为目标，以研发鱼用疫苗科技、检验方法及疫苗产品，分析鱼苗育成条件，建立安全无病毒之鱼苗生产方法。解决产业发展瓶颈，带动国内水产养殖产业之科技化及产业升级，并以建立成国际领先之石斑养殖研究及人才训练中心作为愿景。

水宝宝

三、 创新科技研发成果：石斑鱼疾病及预防生技医药的科技研究成果

鱼类与一般我们熟悉的哺乳动物不同，就是其受精卵到鱼苗(胚胎)是在水中(体外)发育，因此鱼的胚胎的营养需求就得由水环境中摄取，同样地、在处于水中的鱼苗在发育阶段就会受到外来病毒或病菌的感染。而在石斑的养殖上，最大的关键瓶颈是在其胚胎发育的营养供应及疾病防治。

目前现行的育苗方法分为全室外式(mesocosms)及半室内式育苗场。二者主要差别在鱼苗育成，前者鱼苗及初期饵料皆在同一室外池，后者则是将鱼苗育成移至室内以避免天候条件影响鱼苗之发育，但初期饵料培养尚在室外。分析石斑鱼苗育成之失败原因，石斑鱼苗之关键条件有下列三项要件:

 需控制病毒感染，方能稳定生产

 得分析育苗条件，才能提升生产效率

 调配初期饵料营养成份，解决畸型率，生产高质量鱼苗

我们由此方向，按序研发，逐一解决困难。成果略述如下：

成果1、疾病控制：可在稚鱼大量群体(massive)同时免疫之口服疫苗技术

虽然注射型疫苗已在人类及陆地养殖动物中大量使用，也成功地控制疾病，但在鱼类中只有冷水鱼种之鲑、鳟类使用之疫苗，而众多之暖水鱼种尚无疫苗可用。因此我们实验室投入暖水鱼种之疫苗研发。

在研发NNV疫苗的过程中，因NNV病情发生于稚鱼不到0.5cm之阶段，不能以注射或集中浸泡的方法免疫，故发展口服疫苗，而口服疫苗必需克服下列瓶颈：(a) 不吃或吃不够；(b) 抗原被肠胃消化系统破坏；(c) 因鱼苗尚在胚胎发育期，若疫苗成份不佳，会造成畸型鱼苗。

实验室开发藉稚鱼之天然食物链，以大鱼吃小鱼、小鱼吃虾米(丰年虾)、虾米吃单细胞生物(细菌)的自然食物链，直接以不活化(inactivated)含NNV抗原蛋白的大肠菌喂食丰年虾，包埋含NNV抗原作为疫苗，再以此丰年虾喂食稚鱼。此疫苗不但在实验证明可有效地预防病毒感染，而且在现场田间实作上也连续成功次数达40 次以上，皆可防止病毒感染，成功率达100%，相较目前坊间育苗场成功率不到10%高出甚多。

此鱼用疫苗关键平台技术(universal platform technology)有如下特色及优点：

结合基因工程可选殖及表现任何病毒或病菌之抗原基因，可开发多种口服疫苗。

以单细胞生物(如大肠菌)内大量表现抗原蛋白，增加疫苗之单位剂量(大肠菌达1000倍) 。

提供双层生物包埋层(bio-layer，大肠杆菌与浮游生物)保护抗原，可减少鱼肠胃消化酵素之破坏。

可发展为多价型疫苗。

利用浮游生物自动滤食单细胞生物之现象，疫苗制造容易，品资均一，品管简单。

因疫苗包理于稚鱼之食物中，一旦投喂可迅速并同时免疫整池全部稚鱼，减少每尾注射之人工、时间及对稚鱼造成之紧迫。

因轮虫及丰年虾多数鱼类之稚鱼皆会摄食，因而此口服疫苗可使用于大部份之鱼类。

可在稚鱼阶段使用，提早免疫。

迅速、同时免疫同池中之所有鱼只。

疫苗成份全为可消化成食物之成份，安全、无残留、无副作用。

此口服疫苗技术成功，不但解决了国际石斑育苗病毒感染的产业问题，而且是国际首次证明可在稚鱼阶段鱼用免疫关键方法的创新发明。

成果2、疾病控制：育成期使用之系列疫苗

我们也汇集台湾养殖区域常见之多种细菌病原，研发多价注射型疫苗，并证明只需注射一次即可在一年的育成期达到预防疾病之效果。

成果3、环境：以隔离式的生物安全(Bio-security)原则、构建亚洲首座无病毒之石斑鱼苗生产系统

我们发现口服疫苗并不能在坊间现有育苗场完全阻隔病毒之感染。其原因是在孵化至二寸苗近六十天的育苗期病毒能自多种途径感染病毒。因此一无病毒之室内养殖场及无病毒初期饵料之生产也是为石斑育苗之必要条件。我们由了解目前坊间之土池及半室内式鱼苗场失败之经验，分析病毒之感染途径在环境中，自行设计一座完全隔离式的石斑育苗场。

水宝宝

成果4、鱼苗发育：分析育苗条件，提升生产效率

在此干净、无病毒(NNV-SPF)的硬体设施下，供应我们研究实验环境。在耗费近六年时间分析石斑鱼苗发育之物理、化学及营养之各项条件，发展了一可隔离外界病毒污染的生产标准流程(SOP)。在硬、软体配合下，加上完善严格的管理，四年来已近四十次连续成功生产每批可达万尾级的先导生产规模(pilot scale)。充份地证明在已有病毒的环境中、若使用此新型完全室内式的石斑鱼苗生产系统，可以成功地生产健康的石斑鱼苗。

成大室内式的石斑育苗生产系统已可完全避免病毒感染，100%的成功再现率，稳定单位生产量，生产高抗病力之石斑鱼苗。达到工业化之”计划生产”方式。其成效见表一。


成果5、营养：调整初期饵料配方、降低鱼苗畸型率

畸型鱼苗常是鱼苗生产上常见的缺陷。我们分析现用初期饵料之成份及鱼苗发育各阶段的营养需求，发展不同初期饵料之营养配方，已可将青斑鱼苗畸型率降低(表二)。大量提升鱼苗之良率。


成果6、 鱼类疫苗推广策略：高抗病力之 (PI-SPR)鱼苗
在能成功养殖石斑鱼苗后，为事先预防田间一般成鱼育成期将遭遇的细菌性疾病，并同时顾虑到养殖户对疫苗使用的陌生，必导致疫苗推广困难。因此、设计一推广策略，亦即将在鱼苗在交付养殖户前，预先注射在养殖过程可能遭遇的多种细菌的疫苗。此预先已防疫的石斑鱼苗(Pre-Immunized Special Pathogen Resistant, PI-SPR)鱼苗，将具高抗病力，因而育成养殖期必有较高存活率。此PI-SPR鱼苗也因此具养殖户使用方便；产品可减少疾病、提高饲养存活率；降低成本、增加养殖利润；鱼苗具品牌形象，不易被模仿及竞争取代及可减少抗生素使用，维护养殖环境等优点。

水宝宝

四.系统整合

团队组合当初、我们依循人类或陆地畜、禽产生技医药研发的模式，很单纯地只往个别疫苗及单一技术进行研发。但努力四年使用于实验室证明有效的口服疫苗，于现有坊间半室内式育苗场却一再失败。依此经验，我们发现在水生动物的疾病控制策略与陆地养殖生活于空气中的动物决然不同。因此在研究及产品研发的观念，研发方向及防疫策略皆由失败经验中学习，重新制订。

以此新观念、以近六年以生产bio-security的原则，整合环境、营养、防疫三个互动的情况，研发系列的解决方法、产品(关键零组件) ，并培育具新观念的人才，再全盘整合，建立数据化的标准作业手册(SOP)。再经三年、进入试量产之工作，进行万尾级的试量产，产品田间试用验证，证明此系统生产的PI-SPR鱼确可协助养殖户大量降低疾病、育成率高，提升经营利润；大量减少抗生素使用、生产无药物残留之鱼货供消费者安心使用；也使水产养殖成为一对环境友善并可永续经营的精致产业。

五、总结

由团队之组合，创新技术的研发，系列预防医药产品之开发，无病毒鱼苗生产系统之构筑及新的PI-SPR高抗病力鱼苗产品之推广策略，一连串由学至产的系列的努力成果及策略规划，我们希望成果能快速技转产业，大量生产PI-SPR的高抗病力石斑鱼苗，供应石斑养殖户使用。供应消费者质量佳、无化学物及抗生素残留的有机石斑。协助台湾传统石斑养殖产业之转型，科技化、精致化。构建可永续经营的绿色石斑养殖产业，也希望藉此持续保持台湾在国际暖水鱼种养殖科技之领导地位。

等风

支持！明天上午准时关注！

水宝宝

上次我们采访杨老师的几个问题，在此也与网友们一起分享下：

问：您是从什么时候开始做石斑鱼疫苗的，这个疫苗针对的是什么病原，此病原的危害有多大？

杨.：我在疫苗研究是1995年由畜产疫苗开始,1999年才转入水产疫苗。开始由育成期多种细菌性疾病开始，在2000年発现石斑鱼苗(胚胎)期会罹犯旋转病病毒(NNV) 非常特殊，在幼水鱼苗如何使用疫苗对科学家也很具挑战。

NNV(Nervous necrosis virus,脑神经坏死病病毒)感染石斑、鲈鱼、比目鱼、海鲡等重要鱼种自胚胎期之鱼苗就会受感染， 不同石斑有不同病毒发病时期，病症: 旋转式游泳 ，病理:脑细胞及视网膜细胞之感染 ，在石斑鱼苗期感染具近100%致死率，渐渐被认为是为国际养殖高价鱼种最棘手的病毒。

水宝宝

问：目前主要应用于石斑鱼的那个成长阶段，免疫的效果如何？

杨：我们目前有二类疫苗系列产品可预防由鱼苗至育成期常见之大部份疾病,达到全面预防之目标。(鱼病多,若只针对一种疾病防疫也是徒劳无功。)

第一类系以鱼苗期以NNV之口服疫苗为主效果可充份预防鱼苗期病毒

第二类是注射性多价型疫苗,成果是达到一年存活率80-90%。结果皆已発表于国际学术期刊(可用google查阅”杨惠郎”或Huey Lang Yang)。并请参阅上述背景说明。

水宝宝

问：该疫苗是否获得商业上批准，正式生产应用在实际生产中？

杨： 应是，但法规上准许耗时，在申请执照中以自家疫苗之方式使用,但不准销售。

问：在大陆，疫苗从研发到正式获得批准进行商业生产并应用于实际生产需要很长甚至几十年的情况，台湾的情况如何？

杨：相同

水宝宝

问：您从事科研工作以及从事疫苗研发，对于您的工作有何感受？

杨：很幸运地、各项研发成果逐渐获得国、内外学产界之肯定。在国内曾获得教育部产学合作奖、生策会国家新创奖(生物医学,2007)、工业局生技创新发明应用竞赛金牌奖(2008)及金、铜牌奖(2009)。在国际上、曾获得惠普(HP: Hewlett Parker)年青学者发明奖，2009年欧洲水产学会最佳墙报奖及2009年”发展中国家科学院农业科学奖 (TWAS Prize in Agricultural Sciences)。除学术上成果也可贡献产业，造福人类。

我们已技转产业，正大量生产PI-SPR的高抗病力石斑鱼苗，希望快速推广此研发成果，

l供应石斑养殖户使用，协助传统石斑养殖产业之科技化、精致化，

l供应消费者质量佳、无化学物及抗生素残留的有机石斑，

l在环境维护上，构建可永续经营的绿色石斑养殖产业。

水宝宝

问：您对疫苗防病的前景怎么看，至少在现在大陆疫苗还不是主要的防病手段？

杨：预防重于治疗。观察人类许多重大疾病防治成功的先例，观察人类许多重大疾病防治成功的先例，往往都是先以疫苗预防疾病，辅以检验试剂确定病原，再以对症之医药(含抗生素)来治疗疾病，这三大医药关键零组件之齐备，才能组合成为现代疾病防治之体系。在水产养殖之过程中，必需有适当的鱼用疫苗可用来生产高抗病力之鱼苗，以事先预防未可预测及突发的疾病；不同之检验试剂在病情初发期可快速确定病原及相关抗药性，以对症下药并可检测疫苗免疫之效用，抗病力之监控及作为鱼苗质量之检定；而医药可只使用于病原已确定、抗药性已侦测过之细菌，作有效，正确的治疗。此疾病防治系统已在人类使用多年、效果也证明良好。在畜产业上之使用也逐渐取代以抗生素预防疾病之劣习。鱼产业中、挪威及欧美也沿用多年证明正确有效。但目前暖水鱼种养殖上，疫苗及检验试剂之一并研发极为迫切，也只有这二件关键零组件之建立，方能配合医药来组合暖水鱼种的疾病防治之体系。

我们已经知道疫苗早已是人类，畜产不可或缺的预防医药。猪，牛，羊，鸡，鸭等畜禽产及宠物用疫苗也是疫苗产业之重点。但是暖水鱼鱼病相当严重，却尚无疫苗、检验试剂之疾病管理系统。我们最近每每看到东南亚的水产品因含氯霉素在欧、美、日本退货的消息，是否欧美日故意使用高检验标准来排斥外货？还是我们也应开始思考养殖是否可以不用抗生素？都是先以疫苗预防疾病，辅以检验试剂确定病原，再以对症之医药(含抗生素)来治疗疾病，这三大医药关键零组件之齐备，才能组合成为现代疾病防治之体系。在水产养殖之过程中，必需有适当的鱼用疫苗可用来生产高抗病力之鱼苗，以事先预防未可预测及突发的疾病；不同之检验试剂在病情初发期可快速确定病原及相关抗药性，以对症下药并可检测疫苗免疫之效用，抗病力之监控及作为鱼苗质量之检定；而医药可只使用于病原已确定、抗药性已侦测过之细菌，作有效，正确的治疗。此疾病防治系统已在人类使用多年、效果也证明良好。在畜产业上之使用也逐渐取代以抗生素预防疾病之劣习。鱼产业中、挪威及欧美也沿用多年证明正确有效。但目前暖水鱼种养殖上，疫苗及检验试剂之一并研发极为迫切，也只有这二件关键零组件之建立，方能配合医药来组合暖水鱼种的疾病防治之体系。

水中乐

这次来了中国大陆之外的专家座谈了。等候……

水宝宝

各位童鞋早上好！是否已经等待很久了呢？

今天我们在线交流将于9点半正式开始，时间只有2小时，邀请的嘉宾是台湾国立成功大学杨惠郎教授，正如楼上所说，是第一位大陆之外的专家哦！！！

杨教授对石斑鱼疫苗有多年的研究，感兴趣的童鞋抓紧时间提问哦！

水宝宝

由于杨老师比较习惯看繁体中文，所以，请所有提问的童鞋尽量用繁体中文哦！

如果你没有也没关系，小编我来帮你转

水中乐

各位童鞋早上好！是否已经等待很久了呢？

今天我们在线交流将于9点半正式开始，时间只有2小时，邀请的嘉 ...
水宝宝 发表于 2012-1-16 08:36

xiaofei27

難得有機會與楊老師交流，很榮幸能提幾個問題：
'.病毒具有很強的宿主特異性，這種特異性在不同魚種的差異大嗎？打個比方，nnv在石斑魚中是重要的病原，在對于其他魚種也會致病嗎？
;.在大陸，魚用疫苗得到了廣泛的認可，但是使用並不廣泛，這種情況的原因是什麽呢？在台灣是否也有這樣的情況？
.NNV在台灣的流行情況如何？
謝謝您的答複。

水宝宝

xiaofei27动作很快哦！感谢参与！

水宝宝

楊老師，上線了先別著急回答問題，先和網友們打個招呼吧！

楊惠郎

回复 36# xiaofei27


    NNV的感染机制但也尚在努力中.

疫苗在台湾目前尚未有官方通過獲得執照的產品,並無實際使用,但需求存在,问题在行政單位核審嚴,注射不方便,價格高,

楊惠郎

各位好,谢謝参與,敬祝新年快樂