乳酸杆菌对对虾养殖池3种常见优势微藻的影响

cjlittlepig

摘自《台湾海峡》

摘要：在实验室条件下，分别把对虾养殖池常见优势种-微绿球藻(Nannochloropsis oculata )、隐藻(Cryptomonas erosa)和颤藻(Oscilla toria )与乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)在对虾养殖水体中共同培养，研究不同生物量的乳酸杆菌对3种微藻的影响。实验分4组，乳酸杆菌分C1( 103 cells/ cm3 )组、C2( 104 cells/cm3 )组、C3( 105 ce lls /cm3 )组、C4( 106 cells/cm3 )组四个浓度。结果表明：不同生物量的乳酸杆菌对不同微藻的影响有很大差异。C1( 103 cells /cm3 )乳酸杆菌对微绿球藻的生长没有明显的影响，对隐藻和颤藻生长有明显的抑制作用。C2( 104 ce lls/cm3 )乳酸杆菌对微绿球藻和隐藻生长有明显的促进作用，对颤藻生长有明显的抑制作用。C3( 105 cells/cm3 )乳酸杆菌对隐藻生长有明显的抑制作用，对颤藻的生长有明显的促进作用。C4( 106 ce lls/cm3 )乳酸杆菌对微绿球藻和颤藻生长有较明显的促进作用，对隐藻生长有微弱的抑制作用。无论是抑制作用还是促进作用，这种作用都随实验时间的延长而减弱。

关键词：乳酸杆菌；抑制作用；促进作用

cjlittlepig

乳酸菌是一类能从可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称[1]。作为一种益生菌，其在水产养殖上的研究多集中在对病原体的抑制、提高水产动物免疫力、鱼类体内栖息情况等方面[2]。微绿球藻是一种海洋单细胞微藻，具有易培养、繁殖迅速、营养丰富的特点，在水产养殖中应用较为广泛。隐藻是天然水域中最重要的鞭毛藻之一，隐藻含量丰富的水塘具有很高的生产力。这两种微藻是对养殖池塘的有益藻种。颤藻不易被水产动物消化并能释放毒素，对水产养殖造成危害，属于有害藻类[3]。

本实验选取对虾养殖池中常见的优势微藻) ) ) 微绿球藻(Nannochloropsis oculata )、隐藻(Cryptomonas erosa)、颤藻(Oscilla toria )和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.) 作为研究对象，把菌藻共同培养，研究乳酸杆菌对三种微藻的影响，以期为此菌株应用于水产养殖生产提供参考并为调控培养微藻、在对虾池塘中构建良好的藻相提供理论依据。

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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源及培养条件
乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)为中国水产科学研究院南海水产研究所健康养殖中心分离保种的菌种。采用MRS培养基：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；柠檬酸氢二铵2g；葡萄糖20g；NaAc•3H2O 5g；K2HPO4 2g；MgSO4•7H2O 0.5g；MnSO4•H2O 0.25g；蒸馏水1 000cm3。pH 值为6.7~ 6.9，煮沸溶解，121℃灭菌15m in，固体培养基加入15g琼脂。将备好的菌种活化后接入200cm3MRS液体培养基中，置于30℃恒温箱中培养24h备用，经平板涂布菌量达1010CFU /cm3。为了避免培养基的带入，离心( 10 000r /m in)，弃去上清液，再用无菌生理盐水冲洗，重复两次。

1.1.2 藻种来源及培养条件
微绿球藻(Nannochlorop sis oculata)、隐藻(C ryptomonas erosa )和颤藻(O scillatoria)均分离自广东湛江东海岛对虾池，保种于中国水产科学院南海水产研究所。培养液：N aNO3 ( 85g /dm3 )、KH2PO4 ( 8g /dm3 )、柠檬酸铁( 0.8g /dm3 )按1B1 000使用。将培养好的微藻放入离心管中离心( 10 000r /m in)弃去上清液，把藻液的浓度调到实验所需浓度。

1.2 方法
1.2.1 实验组设置
实验组设置如表1所示。

1.2.2 培养条件
实验微藻在500cm3 锥形瓶培养，水浴控温，温度为27~ 29℃，光照强度4 000 lx，光暗比为12B12，盐度为15，每3h摇动藻液1次，实验周期为12d。

1.2.3 容器及培养液的处理
锥形瓶经120℃高温灭菌备用。培养液：汕尾市红海湾湖东养殖场对虾高位池排出的养殖水体。取一部份水样用氯仿固定，测定水中NH4-N、NO3-N、NO2-N、PO4-P、COD 的含量和pH值，测定方法参考5海洋监测规范6[4]，煮沸后再次测定，适当调整营养水平(加对虾饲料粉末和营养盐)，使COD的值达到6.72mg /dm3；NO3-N的含量达到0.49mg /dm3；NO2-N的含量达到0.03mg /dm3；NH4-N 的含量达到0.11mg /dm3；PO4-P的含量达到0.40mg /dm3。水体pH 值为8.75。

1.2.4 取样及测定
每天在实验组1取1次菌样，用平板涂布计数法计数。每2d在实验组2~ 4取1次藻样，并以甲醛固定，用血球计数板在显微镜下计数(颤藻经过超声波破碎后计数) 。

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2 结果

2.1 不同生物量的乳酸杆菌在养殖水体中的生长变化情况

如图1所示，乳酸杆菌的生物量随培养时间的延长而递减。C1( 103cells /cm3) 组乳酸杆菌的生物量在第3 天降低到0，C2( 104 cells /cm3 ) 组乳酸杆菌的生物量在第4 天降低到0，C3( 105 cells /cm3 ) 组乳酸杆菌的生物量在第5 天降低到0，C4( 106 cells /cm3 )组乳酸杆菌的生物量在第7天降低到0。

2.2 不同生物量的乳酸杆菌对微绿球藻生长的影响

如图2所示，藻细胞浓度变化是随着乳酸杆菌添加浓度的变化而变化的，乳酸杆菌对微绿球藻无论是抑制作用还是促进作用，都随微藻生长期的延长而减弱。C1( 103 cells/cm3 )组乳酸杆菌对微绿球藻生长没有明显的影响。C2( 104 cells/cm3 )组乳酸杆菌对微绿球藻生长有明显的促进作用。C3( 105cells/cm3)组较特别，前4d乳酸杆菌对微绿球藻生长起促进作用，在此以后，起抑制作用，第10天抑制作用达到最大，藻细胞浓度为对照组C0的82.35% ，此后抑制作用随实验时间延长而减弱，第12天这种抑制作用消失。C4( 106 cells/ cm3 )组乳酸杆菌对微绿球藻生长有较明显的促进作用。

2.3 不同生物量的乳酸杆菌对隐藻生长的影响

如图3所示，藻细胞浓度变化是随着乳酸杆菌添加浓度的变化而变化的。C1( 103 c℃lls/cm3 )乳酸杆菌对隐藻生长有明显的抑制作用，这种抑制作用在第6天达到顶点，第10天抑制作用消失，第12天藻细胞浓度恢复为对照组C0的94.17%。C2( 104 cells/cm3 )乳酸杆菌对隐藻生长有明显的促进作用，这种促进作用第8天达到最大，藻细胞浓度为对照组C0的125.77%。C3( 105 cells/cm3 )乳酸杆菌对隐藻生长有明显的抑制作用，这种抑制作用一直持续，第12天达到最大，藻细胞浓度为对照组C0的55.34% 。C4( 106 cells /cm3)乳酸杆菌对隐藻生长有微弱的抑制作用，这种抑制作用一直持续，第12天达到最大，藻细胞浓度为对照组C0的81.55%。

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2.4 不同生物量的乳酸杆菌对颤藻生长的影响

如图4所示，藻细胞浓度变化是随着乳酸杆菌添加浓度的变化而变化的。C1( 103 cells /cm3 )组乳酸杆菌对颤藻生长有明显的抑制作用，这种抑制作用随培养时间变动有些曲折变化，整体呈下降趋势，第12天恢复为对照浓度。C2( 104 cells/cm3 )组乳酸杆菌对颤藻生长有明显的抑制作用，这种抑制作用比C1组持续时间长，仍呈下降趋势，抑制作用渐渐减弱。C3 ( 105 cells /cm3 )组、C4( 106 cells/cm3 )组乳酸杆菌对颤藻生长有明显的促进作用，不同的是C3组在生长前期(第6天)促进作用达到最大，藻细胞浓度为对照组C0组的157.14%，C4组在生长后期(第10天)促进作用达到最大，藻细胞浓度为对照组C0组的176.74% 。

2.5 小结

从以上实验结果可以看出，乳酸杆菌在养殖水体中不能持续生长，生物量不断降低，只能生存几天时间，尽管如此，乳酸杆菌对3种微藻的抑制或促进作用仍很明显。C1( 103 cells/cm3 )组乳酸杆菌在养殖水体中只能生存3d，对微绿球藻生长没有明显影响，对隐藻和颤藻生长有明显的抑制作用。C2( 104 cells /cm3 )组乳酸杆菌在养殖水体中只能生存4d，对微绿球藻和隐藻生长有明显的促进作用，对颤藻生长有明显的抑制作用。C3( 105 cells/cm3 )组乳酸杆菌在养殖水体中能生存5d，对隐藻生长有明显的抑制作用，对颤藻的生长有明显的促进作用。C4( 106 c℃lls/cm3 )组乳酸杆菌在养殖水体中能生存7d，对微绿球藻和颤藻生长有较明显的促进作用，对隐藻生长有微弱的抑制作用。

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3 讨论

乳酸杆菌可能分泌了某些对藻类生长起调控作用的物质，这些物质在不同浓度下对藻细胞有不同的影响。Vizoso等( 2006)发现从人粪便和发酵产品上分离的两株乳酸菌具有体外抑菌活性，并认为是乳酸菌产生的有机酸在起作用[5]。Shahan i等( 1997)认为乳酸杆菌产生的复合物可以抑制其它微生物的生长，其中细菌素是最主要的，而过氧化氢、乳酸也有一定的作用[6]。乳酸杆菌在发酵过程中产生大量的乳酸，可使培养液的pH 值下降，可能是影响微藻生长的一个因素。余颖等( 2005)发现微绿球藻的生长对pH 有较强的适应性，在pH 值为6.2~ 9.8的范围内均能较好的生长，但在pH 值为5.5和pH 值为6.2的酸性条件下，营养源的吸收受到阻碍，藻细胞的生长受到抑制[7]。冯竞楠等( 2005)发现适宜隐藻生长的pH 值范围为6.5~ 7.5，当偏离这个范围时，藻体生长和体内代谢活动都将受到抑制[8]。藻类和细菌间还存在着复杂的共生关系，这种关系也可能是影响乳酸杆菌与3种微藻生长的一个因素[9]。

黄翔鹄等( 1998)人工引入波吉卵囊藻(Oocy stis borgei snow )和微绿球藻(N annochlorop sis oculata )于凡纳滨对虾(P enaeus vannamei) 养殖环境中，结果表明：引入波吉卵囊藻和微绿球藻能改善养殖水体的水质[10]。颤藻(Oscilla toria )、两栖颤藻(O scillatoriacea℃amphilia)有较强的吸收磷的能力，实验水体中约3 /4的磷在藻类生长过程中被吸收，另有1 /4的磷是在藻体基本停止生长后被藻细胞吸收聚集[11]。周海平( 2005)就乳酸杆菌对养殖水体、饲料的降解作用进行了研究[12]，结果表明：各个实验组中NO2-N、NO3-N、PO4-P的浓度从实验第1天到第4天一直处于下降趋势，而NH4-N 呈上升趋势，对COD 无降解能力，温度、菌浓度、底物浓度对NO2-N、NO3-N、PO4-P、NH4-N 降解率的影响是极其显著的。以上研究结果可以看出，乳酸杆菌与颤藻、微绿球藻可以改善养殖水体的水质，水体中氮磷等物质的改变也可能间接影响乳酸杆菌与微藻的生长。

本实验在实验室条件下进行，温度、光照等环境因素是恒定的，水体中没有外源有机物和无机盐的补充，实验结果在此基础上产生，随着培养时间的延长，养殖水体中营养物质迅速消耗，溶解氧、二氧化碳的量也随着微藻的生长而改变。以上各种因素的影响，可能对微藻和乳酸杆菌的生长有一定作用。综上所述，乳酸杆菌对三种微藻的影响机制非常复杂，有待进一度研究。

cjlittlepig

4 应用前景展望

大量研究表明，乳酸菌能够调节机体肠道的正常菌群，保持微生态平衡，增强机体的免疫功能，提高机体的抗病能力，产生抑菌代谢产物，如乳酸菌肽、细菌素、乳酸、过氧化氢、乙酸等，对许多革兰氏阳性菌( G+ )及革兰氏阴性菌( G- )有强烈的抑制作用，可抑制肠道腐败菌的生长繁殖和腐败物的产生。水产养殖中，桂远明等( 1993，1994)报道，乳酸菌等微生物制剂对鲤鱼具有促进生长和提高抗病力的作用[13]。乳酸菌作为水质净化剂也日渐引起注意，并逐步得到应用，多是作为EM 菌剂的主导菌用于水产养殖水质净化，效果良好。

微绿球藻在水产养殖中的应用较为广泛，是近年来泥蚶、蟹[15]、虾[16]等育苗及轮虫[17]培养中应用较佳的优良饵料。微绿球藻净化稳定水质的能力好，能抑制有害藻类过度繁殖，提高中华绒螯蟹幼体的变态成活率[15]。隐藻有较高的营养价值，加之其无纤维素的细胞壁极易被消化吸收，是鱼类及某些珍贵水产养殖动物的优质饵料之一。

本实验证实，可以通过调节乳酸杆菌的生物量起到抑制或促进微藻生长的作用，希望对有益微藻的培养、有害微藻的防治、微生物水质净化剂的应用有参考意义。本实验在实验室中进行，养殖环境下乳酸杆菌对对虾养殖池塘微藻的影响如何，有待进一步研究。

cjlittlepig

daoming4

微生物既有好处，也会带来意想不到的坏处，特别是在实际生产中，微生物的添加都是随意的，对于用量根本就无法控制。

cjlittlepig

daoming4 发表于 2012-12-10 13:37
微生物既有好处，也会带来意想不到的坏处，特别是在实际生产中，微生物的添加都是随意的，对于用量根本就无 ...

任何技术在应用发展阶段都如此，我们需要利用好的，改进坏的，对吧！对于用量控制，一般投放生物量控制在10^4CFU/ml左右。

apple

谢谢分享，学习一下

cjlittlepig

apple 发表于 2014-10-22 10:39
谢谢分享，学习一下

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叶子

很好的文章，谢谢楼主的分享哦