免费发布：急性肝胰腺坏死病检测方法

cuiluosheng

附件内的《急性肝胰腺坏死病检测方法公告》为泰国Mahidol大学Tim Flegel教授与台湾成功大学罗竹芳教授最新发布的检测方法公告，在阅读他们公告的过程中深为二位专家以及他们团队的行业责任感所折服，为此，学习完报告之后，遂尽自己的微薄之力将之翻译好，供行业相关人员参考、交流、学习！


AHPND细菌PCR检测方法公告.pdf (654.78 KB, 下载次数: 32)

2013-12-30 12:54 上传

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阅读权限: 80

胡路怡

好文章好文章，崔兄辛苦了哈

一醉千年

崔兄速度够快！我上午看着新闻了，英文不够好，勉勉强强翻译了两段。你这全文翻译了，辛苦辛苦！

my_chb

{:soso_e179:}

daoming4

非常感谢能够将前沿信息及时传递给大家，只是感觉翻译的有点生硬。

raymin

支持支持支持支持支持

zjxenter

谢谢分享呀  以后用到再下载 呵呵

cuiluosheng

daoming4 发表于 2013-12-26 14:01
非常感谢能够将前沿信息及时传递给大家，只是感觉翻译的有点生硬。

水平有限，有些英语长句读着读着就晕了！

kanhai

小崔开始走国际路线了

cuiluosheng

此文为台湾成功大学发布的新闻稿，其中关于检测结果的部分翻译更加准确，请各位大侠参考这份为准！
自2009年开始，亚洲虾类养殖开始爆发一种未知的新兴疾病，渔民发现在放苗后的30天内，虾苗会出现大量死亡，因此得名为偷死症或早死症 (early mortality syndrome, EMS)。病虾的肝胰腺会变白及萎缩，且此器官变得难以用手指搓碎；在组织切片检验下，肝胰腺细胞呈现坏死及脱落至肝胰腺小管外，亦有大量的血细胞侵入肝胰腺，造成严重的发炎反应。也因为本疾病会造成虾类肝胰腺功能严重受损，因此EMS的正式疾病名则称之为急性肝胰腺坏死综合症 (Acute Hepatopancreas Necrosis Disease，AHPND)。直至今日，此疾病已在中国大陆、越南、马来西亚和泰国等重要虾类养殖大国爆发，平均一年因AHPNS所造成的损失超过十亿美元。
        由于AHPND已渐扩展并威胁着全球虾类养殖产业，科学家、养殖企业及第一线养殖业者共同齐心寻找其致病原因。在2013年5月时，位于University of Arizona，隶属于世界动物卫生组织参考实验室(OIE reference lab)主持人Prof. Donald V. Lightner首度鉴定出Vibrio parahaemolyticus (VP)乃AHPND的致病原，此研究对于养虾产业解决AHPND威胁跨出了重要的第一步。然而，对于虾类养殖产业而言，他们亟需检测平台以协助检测种虾、虾苗、生物饵料…等等是否带有此VP变异株，藉以阻断病原体在虾场中的侵入与散布，得以降低AHPND爆发的可能性。由于致病性VP检测平台于虾类养殖产业生物安全管理上的必须性及绝对重要性，大家对此都引颈期盼并迫切需要，一旦有高专一性、高灵敏性的检测平台建立，将是解决全球AHPND爆发的关键技术。
        本校生物科学与科技学院院长罗竹芳院长带领其研究团队，与泰国Mahidol University的Professor T.W. Flegel进行跨国合作，于今年(2013年)12月，领先全球公布了「先导型AHPND关键检测技术平台」，可以短时间内检测出致病性VP的存在，并以公开信息的方式，免费提供给全球养虾产业使用。在此公开、免费使用的操作模式下，省去准备专利申请文件、证照、商用检测试剂盒上市诸如此类冗长的等待时间，藉由检测方式帮助相关业者制定有效方针因应AHPND爆发，立即性的阻绝AHPND的传播路径，并降低全球养虾产业经济损失。此外，这个关键检测技术平台的建立，除了是成功的跨国合作案外，藉由国立成功大学、统一企业总公司、台湾行政院国家科学委员会以及国立台湾大学的紧密互动下，成为产学合作、解决产业困境的典范案例。
        利用了次世代定序及系统生物学方式，罗院长及其团队利用全基因体解序策略，发现具有致病性的VP带有特殊、独立于染色体DNA之外的大型质体DNA，目前也推测致病的细菌毒素基因也应位于此质体DNA上。因此罗院长利用质体的特殊序列做为侦测目标序列，设计出AP1及AP2等两对引子对，以PCR技术做为检测方式，希望能在更深入的研发过程之前，先以此发展为「先导型AHPND关键检测PCR技术平台」。若生物体存在有致病性VP，理论上可同时被AP1及AP2侦测到阳性反应。虽然此检测平台的效用还需要大规模的样本测试，但由于情况紧急，罗院长及泰国团队决定先行公开这项初步但重要的信息，得以减缓养虾产业因AHPND所造成急遽攀升的经济损失。
        由于此为「先导型检测PCR技术平台」，基于研究责任道义，罗院长团队及泰国团队对此提出数项声明与前驱检测成果阐释，使此技术平台更加透明化:
1. 在更大规模的生物样材测试前，我们不能保证此PCR检测方式不会对所有非AHPND致病菌及相关生物有反应。我们也不能保证此方法能够侦测出所有造成AHPND的细菌。但我们诚挚邀请所有相关业者协助验证这项新的检测方法。
2. 在测试的68个生物样本中，有67个样本利用此两对引子对(AP1及AP2)得到相同的阳性或阴性结果。然而有1个样本利用AP1得到阳性结果，用AP2则得到阴性结果。
3. 在联合国世界粮农组织(FAO) 于越南地区的研究中，收集的14个样本中，有5个组织病理切片判断为阴性结果的样本，利用此法检测也同为阴性结果。然而，在8个组织病理切片被判断为AHPND阳性的生物样本，利用此PCR检测平台检测后，有5个同样为阳性结果，但有3个为阴性结果。
4. 在68个被推论可造成AHPND的测试细菌样本中，利用此PCR方法检测都呈现阳性结果。而于2002年的池塘采集样本中，有3株细菌已被确认它们不会造成AHPND也不会造成虾只死亡，利用此PCR方法检测后得到阴性结果。
5. 测试过程中发现有一菌株，虾体致病后的组织病理切片显示，虽非AHPND，但实际却造成虾只严重死亡及不正常肝胰腺病理切片，利用此PCR方法亦是得到阳性结果。
6. 利用此方法检测Shewanella, Rhodococcus, Leifsonia, Delftia, Ralstonia, V. vulnificus, V. harveyi, V. alginolyticus以及 B. subtilis都得到阴性结果。

        罗院长表示，希望「先导型AHPND关键检测PCR技术平台」能够加快对于AHPND传染机制的了解进而达到最终的疾病控制。此外，罗院长团队也非常欢迎任何单位使用此方法后所能提供心得及任何宝贵建议。


「先导型AHPND关键检测PCR技术平台」于AHPND致病菌检测操作步骤

除了下述的实验流程之外，用户也可利用下述序列进行较短的PCR产物反应或巢式PCR法的检测设计。然而这些经改良的方法会产生许多伪阳性的结果，因此这些改良的方法比较不建议使用。利用AP1及AP2两对引子对，各自能产生约700 bp的PCR产物。详细实验流程如下。
1. 利用一般DNA萃取方法，萃取感染虾只的胃、肝胰腺或分离的菌株DNA。
2. 于25 μl PCR反应体积中，加入10-100 ng范围之间的上述DNA萃取物。
3. 两对引子对(AHPND primer set 1 [AP1]及AHPND primer set 2 [AP2])主要使用在放大AHPND bacterial DNA片段。以下为正股及反股的引子序列:
AP1F: 5’- CCT TGG GTG TGC TTA GAG GAT G -3’
AP1R: 5’- GCA AAC TAT CGC GCA GAA CAC C -3
AP2F: 5’- TCA CCC GAA TGC TCG CTT GTG G -3’
AP2R: 5’- CGT CGC TAC TGT CTA GCT GAA G -3’
4. PCR反应的条件为: [94°C 5分]-[(94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 60秒) 此三步骤重复25~30次]-[最终的72°C 10分]。随后PCR产物将进行琼脂胶体电泳之后，经由溴化乙锭染色然后照射紫外线后可看到PCR产物。AHPND阳性的样本，可看到约700 bp的产物，然而AHPND阴性的样本则看不到PCR产物。如果需要阳性对照组的话，可以连络罗院长研究团队，其可寄送含有目标片段的质体DNA，可以经由大肠杆菌系统放大及保存，可供永久使用。


PCR Protocol
Pre-heat: 94°C, 5min
PCR 25~30 cycles with:
Denaturation: 94°C, 30 sec
Annealing: 60°C, 30 sec
Extension: 72°C, 60 sec
Final extension: 72°C, 10 min
Amplicon: ~700 bp

PCR Primers and Target Sequences
AHPND Primer Set 1 (AP1)
AHPND Primer set 1 Forward (AP1F) –
5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’
AHPND Primer set 1 Reverse (AP1R) –
5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’
AP1 Amplicon- 700 bp
AP1 Target Sequence
CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATGATGAAGATGACTATGTCCTCGAACGATTTGAGTTGCGAGT
TCACGGTCGTAAACCACTCGTTCTCAATCGCCCCTCGTTTTCCAAACTCATGTTCGTCACCC
AGCAGTATCTCCACACGTCACAGGAAACCACCAAGCGAATATTAAGAGCCACCATCTTAGAA
AGTGCTGAGCCCTTCACGGCGGATGAACACTGCCGATTGGTCTCTGCACTCGAAAGGCACTT
AGCTGACGTCCATGAATGAAAAAACCCGATAACATCATCATGTTATCGGGCTATTTGGTGTC
ATCAGTGTGTTTGTGTTTGGCGGTTTTACAACCATTCTTCAGCACATTCATGTGTTATCGCA
TCAGTGGTTTCAGTGATCGTGGCAGACTGAAACCCGCCGACGATGGGATTTAACGCTAAATT
CGCTACTCTCTTCGCCTCATCAAAGCAAGGAAGCACTGCAACGTACTCCTTACCCCAACTCA
CTTCAAGCGTAACTCGGCAAGCACCTTTATACCCAACCGAAACATGAACTTCTGCATCAAGC
CGGTGTTCATCGCCGTTCAATAATGAATTCATCAGCGCGCCCTCGTTAAAGAGCATTAGAAG
TGATGCACTGGAATGTTAAACCAACACACCAATGCATCGTAGAACGCCGAAATAACAGGGTG
TTCTGCGCGATAGTTTGC

AHPND Primer set 2 (AP2)
AHPND Primer set 2 Forward (AP2F) –
5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’
AHPND Primer set 2 Reverse (AP2R) –
5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’
AP2 Amplicon- 700 bp
AP2 Target Sequence
TCACCCGAATGCTCGCTTGTGGCTCAGCGAGCATGGGGTCACGCCTCTATAAGTGCAAAAAC
TCTGGCTGTACCTACTACACCAAATACCTCAATCAAAGCTGTAAGTCTCGAGCTTGCTGCAG
TGGTGGCGTCAAATCCACCGAAAGGTGGATGGTTGCTTAATCGATTATTCAAATGCGCGTCC
AACATTTTAACGACTTGGGCGAAACGGCAAGACTTAGTGTACCCAGAGCCAAAACCTCATCG
AAAATCAGGATTGTTGCTTCCTACGTTGAAAGACCGGCGTTATCAGCTTCATATCCCCCACC
TCTGTCACGCCTGCGTGGATCGCTGAATGACTGTAAAAAATGACAATAAAGATTGATCAATC
TCAGAAACGTTTTGGGACAAAAATGGTTCAACAATATCTGCTGGGTATGTGGCTATCCAAAC
AATATTCTTGATAAAGGCTGGGAAATGGAAAATTCACTCTCCAAATACACCAAATTAGTACA
GAAATTTATACAATTACAGTAACATGAATCCGTCATACTGGCAGCAAGGAGTTCATGTGAGC
CAACAAGAAGAAAAATACCCGGCCAGCGCCATATCCTCCTGGAGCGGCTTTGTTTACCAAGG
AAAAGTCGCACTATATCACTCACTTAAGCTTATTCTCGATGATGATTTGGACTTCGAACTTC
AGCTAGACAGTAGCGACG

如需详细信息，请点阅以下网址:
http://www.shrimpnews.com/FreeRe ... anFreeEMStests.html

cuiluosheng

kanhai 发表于 2013-12-26 21:07
小崔开始走国际路线了

被逼的啊，没有办法！

syusuke

@Dannyhuang  @拜耳刘涛  @haoye520  @海上积雨云   @虫子的悲哀
好资料  快来围观哦

Dannyhuang

各位好！非常钦佩这些学者的专业知识和责任感。有几个问题还是想和大家讨论一下：1.急性肝胰腺坏死病的病原是否已经确证为副溶血弧菌？可能称之为“一株变异副溶血弧菌的检测方法”较好。2.好像不是所有患肝胰腺坏死病的对虾中都可以分离到副溶血弧菌？3.细菌PCR鉴定需要套式PCR检测吗？可否更简单？4.样本数。
以上仅供讨论参考。谢谢！

烟花雨

Dannyhuang 发表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常钦佩这些学者的专业知识和责任感。有几个问题还是想和大家讨论一下：1.急性肝胰腺坏死病的病原 ...

太高深了，表示看不懂啊！

Dannyhuang

接地气啊！

cuiluosheng

Dannyhuang 发表于 2013-12-27 13:03
各位好！非常钦佩这些学者的专业知识和责任感。有几个问题还是想和大家讨论一下：1.急性肝胰腺坏死病的病原 ...

Danny提的问题非常好，可以跟台湾成功大学罗竹芳教授发邮件交流你的想法！

hugo

楼主辛苦了，你们这些资料一般在哪个网站找到的呢？我以后也好关注最新信息

hugo

如果跑了电泳之后，还有一个测序结果就更好了，现在还难以确定他们的扩增片段就是目标片段

cuiluosheng

此为免费下载通道！

Dannyhuang

大家比对一下序列，看看是不是？