在线交流 | 如何扩培沼泽红假单胞菌、乳酸菌种、芽孢杆菌？

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一片云

6月18日晚交流的内容
乳酸菌的建议扩培及应用


目前乳酸菌制剂在水产养殖业中，泼洒在水体中的量远远大于拌料内服的量。其在畜禽养殖业中不会泼洒到环境当中，而是通常添加在饲料中，但是用量不大。

　　一、乳酸菌简介
　　


　　通常我们所说的乳酸菌也叫乳酸杆菌。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能在葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。除极少数外，其中绝大部分都是动物体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群。人类肠道含有大量的乳酸菌群。养殖动物的肠道里面（尤其是恒温动物）含有大量的乳酸菌群，水产养殖动物的肠道中也有。
　　
　　常见的菌种主要包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌等，这些都属于兼性厌氧、革兰氏阳性菌。在有氧的条件下它们同样也是能够存活和继续繁殖。
　　
　　我们在超市里面买的各种各样的酸奶实际上都是很多种被卫生部批准用于人食用的乳酸菌的发酵产物。咱们定期的在食物中补充一定的酸奶能够促进消化，增加肠道内的有益菌群数量，提高免疫能力。
　　
　　今天讲的主题是干酪乳杆菌，以它为代表，把它放在水产养殖业中是因为干酪乳杆菌的功能正好被水产养殖业能够利用到，而且我们认为它比其它几种乳酸杆菌的效果更好一些。

一片云

　　二、乳酸菌在水产养殖中的作用


　　
　　乳酸菌在水产养殖业中的作用主要体现在以下几条：
　　
　　1.肉眼可见的：诱食、肥水； 用于外环境的时候，早上用第二天肉眼就可以见到鱼的食性增强。比如说在没有用乳酸菌之前，吃食鱼在早上的欲望比较低，吃食鱼的面积相对来说小一些。用了乳酸菌之后，第二天早上同样的时间段你再去投喂，会发现吃食鱼的面积明显比没有使用乳酸菌前扩大了，而且是很明显的扩大了，跟下午是一样的。这就说明，它有一个肉眼可见的诱食作用。其实这个诱食的作用就是改良了水质。 还有一个，你会发现用了之后水通常会变肥。变肥指的是水体当中的微生物、浮游植物、原生动物、浮游动物等在水体当中数量变多了，也就是增殖了，多了之后我们肉眼看到的就是水变肥了，就是这么一个现象。
　　
　　2.间接的增氧、改良水质；
　　
　　乳酸菌由于它把水体变肥了，会对水体产生间接的增氧作用。虽然它本身不产氧，但是它培养了大量的浮游植物，因此间接的增氧作用是很明显的。
　　
　　3.喷洒在饲料上投喂，增加养殖动物肠道内有益菌，显著提高饲料利用率；提高免疫力，降低肠道疾病发生率。
　　
　　在水产养殖中，我们也会把乳酸菌制剂按照一定的比例喷洒到饲料中投喂，增加养殖动物肠道内的有益菌（当然这个要求就是你拿到的乳酸菌制剂是真的是活菌，而不是纯的代谢产物，这个问题我想后面要专门说一下）。
　　
　　喷洒到饲料上可以显著的提高饲料的利用率、降低饲料系数，提高养殖对象的免疫力，降低肠道疾病发生率。
　　
　　这里有些科研的报告，我想给大家说一下。我们用乳酸菌投喂之后和之前草鱼肠道内的肠壁皱褶发生明显的改变。饲料添加乳酸菌其结果是中肠、后肠的肠壁皱褶都明显的变多了、变长了、变密了，意味着肠道内壁的表面积扩大了。食物和肠道内壁的接触的表面积扩大之后，它吸收食物当中的有效成分的速度就更快了，消化功能也提高了，食物的分解更彻底了，营养吸收得更多了，结果有效地降低了饲料系数，提高了肠道内的有益菌的数量。
　　

　　根据2008年农业部批准的使用的饲料添加剂中的安全微生物，农业部的公告1126号文件，实际上有十多种都是乳酸菌。

　　干酪乳杆菌
　　
　　今天讲的干酪乳杆菌我们称之为水产专用，因为在相应的对比实验中干酪乳杆菌应用到水环境中的效果比其它的乳杆菌表现得更突出一些，虽然这个差别不是特别的明显，但是我们还是认为以这种菌为主的话可能得到的结果会比其他的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌为主的效果好。

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三、菌种来源
　　


　　菌种经过农业微生物学国家重点实验室保种和选育，然后经过华中农业大学生命科学技术学院一级扩培，再到我们公司的二级扩培，最后做成成品来销售。
　　
　　之前，乳酸菌主要还是用在城市生活污水处理当中，在这个过程当中我们发现把乳酸菌运用到水产养殖业上也可以起到很好的效果，因此乳酸菌在08年的时候我们才开始逐步的往水产养殖业上推广干酪乳杆菌，实际上我们现在生产的是以干酪乳杆菌为主的复合乳杆菌。
　　
　　我就不再重复地去介绍我们的华中农业大学生命技术学院了。因为在之前已经讲过了。

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　　四、乳酸菌的扩培


　　
　　乳酸菌简易扩培需要的设备（我们现在讲的都是简易扩培，指的是大型的养殖户或者小养殖户都可以做到）
　　
　　1、容积1吨或者0.5吨的不透明的塑料罐，白色为宜。如果你是小养殖户，可以采取有盖的白桶，密封的都是可以。
　　
　　2、恒温电加热控制装置，因为乳酸菌在恒温动物中大量的存在。比如说我们人类的体温正常体温36.5℃左右，差别不会太大。猪马牛羊鸭等也基本上是37-40℃这个样子，体内的温度相对来说是非常稳定的。在培养乳酸菌制剂的过程中也要求培养的温度基本保持在38℃。
　　
　　3、自来水——无菌水制备设备，和家里送来的纯净水实际上就是用这个设备做出来，原理是一样的，有大有小，大家可以看到后面的课件上的不锈钢的设备。
　　
　　4、功率不超过100瓦的潜水泵。潜水泵起的作用是不断的在罐体内搅拌，把容易沉到底部的比较的培养基均匀分布在罐体内（被我们的菌种利用掉）。
　　
　　这些设备温控装置很简单，你也可以做得更精致一些，像图像上这种温控装置的成本大概不到200块钱。如果你要做得更精致一点的话，可能要加一个配电箱（相应的东西全部装在配电箱里面），再配上一个温度探头再配上一个U型的加热管，加起来的成本可能就超过300块了。
　　

　　大家看干酪乳杆菌简易扩培设备这张图，图中罐体中只有1/3的发酵，这是一个浓缩发酵。也就是一组培养基+一组菌种，然后只加了330kg无菌水，最后再发酵的过程。也就是有些企业做1L的产品，1L EM菌或者乳酸菌用于3亩的水体的这样一个浓度的浓缩液。也可以把罐子里面的无菌水（990kg）全部加满，做成一般的市场上5升的瓶子装用于5亩水体的浓度的稀释液。浓缩和稀释的实际上最后的比例是一样的，用量的比例是一模一样的。
　　




　　另外一个罐子无论是方的还是圆的都不影响产品的质量。
　　
　　自动温控搅拌装置
　　


　　大家可以看到一个很简单的塑料的潜水泵和一个热得快。热得快是针对小型养殖户的，他用这种就可以了。但这热得快只有1.5千瓦，它比较容易烧坏。建议如果用1吨的大罐子去做简易扩培的话就用3千瓦的工业用的加热管，加热管相对来说，速度更快，而且不容易坏，这张温控设备上有一个电子温控器和空气开关这都是为探头服务的。
　　


　　不锈钢过滤罐
　　




　　无菌水从不锈钢过滤罐的上方进入，从下方出来（图片没有把下方照出来）然后通过紫外灯的灭菌装置一头进一头出，那么基本上可以把水当中的杂质以及浮游植物和所有的微生物都能够杀死掉了，接近于纯净水的标准（我们说的无菌水就是这个意思）。通过这两个设备得到的就是无菌水，这个无菌水我们就把它加入罐体当中。

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　　五、干酪乳杆菌菌种定向培养基
　　


　　照片当中只照到了5个5L的瓶子，其中2个比较浅的灌得比较满的咖啡色瓶子是两瓶菌种，剩下的3瓶就是培养基。实际上标准化的是4瓶培养基，图片上只照了3瓶。
　　
　　1、培养基的原料配方
　　


　　浓缩乳酸菌原料配比：10L菌种+ 330kg的无菌水；
　　
　　成品乳酸菌原料配比：10L菌种+990kg的无菌水
　　
　　2、培养方法
　　


　　①        首先将乳酸菌的浓缩培养基加适量的水煮沸5分钟以上（大家记住一定要煮沸5分钟以上），杀灭其中所有的微生物。如果不到5分钟，没有煮沸，那么做出来的杂菌可能就比较多。
　　
　　②        补充无菌水到330kg，或者做直接的产品，那你就直接补到990kg。
　　
　　③        加入菌种开始培养，培养的过程把培养液的温度保持在35-40℃，建议直接在温度控制开关上把它调整到38℃，这是最合适的。
　　
　　在38℃恒温条件下培养36-48个小时，基本上可以完成培养。如果你要做稀释的，那在这个时候再加入660公斤无菌水就可成为乳酸菌的成品，灌装或者直接使用。
　　
　　乳酸菌的稀释成品和浓缩成品到底有什么区别？无非就是浓缩的1L用3亩水体而稀释的1L只能用1亩水体，所以大家在市面上买的相应的乳酸菌类的产品，5升装的如果用5亩说明他用的是我们说的990公斤水加上培养基和菌种做出来的。如果1L的产品可以用3亩水体那就是浓缩的方法做出来的（还能不能更浓缩了呢？不能了）。
　　
　　乳酸菌的浓度问题，因为乳酸杆菌是有体积的，虽然它很小。目前这种大规模的工厂化生产，简易扩培的方式，能够做到的最高浓度基本上也就是我刚才讲的330kg无菌水+一组定向培养培养基+菌种，然后灌装出来的成品。如果你同样灌装5L的油壶，你就可以用到15亩水体。

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　　六、注意事项
　　


　　1、在扩培乳酸菌过程中，先加入无菌水，其次加入煮沸5分钟以上的定向培养基。加水需要很长的时间，所以我们一边加水一边煮培养基。培养基煮沸5分钟以上后，再把它倒入到罐体中，水可能还没加满，这时候你一定要注意在加水的过程中尽可能的将培养容器的盖子盖在口子上面，减少空气当中的细菌落入到罐体中的机会。另外等所有的东西都加好后一定要盖盖子。
　　
　　盖完盖子之后还建议大家用胶带密封，以免空气中的微生物掉到罐体当中造成污染，蚊虫都有可能在简易扩培时飞到罐体中去（这个是经常发生的）。
　　
　　2、培养容器使用过后要及时清洗，使用前还要用消毒剂进行消毒处理（消毒剂通常是二氧化氯），将二氧化氯直接喷雾到罐体的体壁上下，进行全部的喷雾，进行消毒处理，消毒之后要继续生产乳酸菌的话，再用无菌水把整个罐体冲洗一遍，把消毒液冲走，变成一个无菌的状态就可以了。
　　
　　3、注意接种时培养液的温度不能高于45℃，防止菌种被杀死。因为乳酸菌温度过高的时候会被高温杀死，所以在生产过程中，大家要记住这个步骤：首先把罐体消毒完之后用无菌水冲洗一次，然后把水放掉，再开始加无菌水，加无菌水的同时把培养基煮沸5分钟，煮沸之后马上倒进去，这个时候水可能还在加，等到水加到快满的时候再把菌种加进去，菌种加了之后立刻将搅拌装置、温度探头、工业用的加热管消毒过后全部放到罐体当中。
　　
　　4、        成品应为正常发酵酸香味，有异臭味则污染杂菌。
　　


　　5、温控装置可以采用热带鱼养殖的电加热温控方式。小规模的生产可以在桶里面做，用电加热的装置。如果温度加不到38℃，只能加到35℃也是行，但是培养的时间就延长。
　　
　　6、无菌水的制备过程就是要用自来水经一级过滤和紫外杀菌器处理获得。没有自来水的地方或者在偏远的湖泊（不是水库），用池塘里面的水或者井水也是可以，但是必须要把它曝气或者烧开，尽可能的消毒。
　　
　　7、最好使用新鲜的菌种（我公司提供的乳酸菌菌种保质期30天），放置时间越长活力就越低，菌数相对来说会下降。
　　
　　成品菌液的浓度基本上可以达到100亿个/ml。
　　
　　成功的制备完毕之后，pH基本上都在3.8左右。能不能做到更低呢？可以。pH可以达到 3.6甚至更低，当pH值低于3.8的时候罐体内的乳酸菌等有益菌数量会随之下降，它虽然是产乳酸的，但是乳酸菌本身对酸的忍受能力是有限的，当pH过低或者低于3.0的时候，大量的菌都被它自己产生的酸杀死了。
　　
　　我们在生产过程发现有些养殖户做得乳酸菌的pH低于3.8甚至更低低于3.0，但把这个产品泼到水里面后仍然是有效的。大家就会问照你这么说活菌都被杀死了一部分，没有 pH值3.8的时候那么高了，为什么你泼进去还是有效呢？实际上乳酸菌比较特殊，乳酸菌本身相对沼泽红假单胞菌和芽孢杆菌活菌来说能够存活下来是比较难的，因为条件不适应。
　　
　　那么问题又来了，我们投下去这些东西到底是什么在起作用呢？是乳酸菌的活菌在起作用还是乳酸菌的代谢产物在起作用呢？实际上乳酸菌的活菌是能够起作用的，在水体当中在它能够存活的不长的时间里，它也起到了很好的作用。它的代谢产物能够促进水体当中的土著微生物包括浮游植物的生长和繁殖。说白了，乳酸菌制剂的代谢产物是其他土著微生物和植物的营养源（我们可以这样理解），当然不是说，它是唯一的营养源而是锦上添花一般的营养源。

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　　七、消毒步骤

　　罐体内部消毒的步骤其实很简单（这里讲的是简易扩培的方式，真正的做菌种不能这么做，真正的生产企业也不能这么做。如果你只销售到周边很近的地方，你可以用简易扩培的方式去做，有点杂菌没关系。如果你销售到很远的地方，你还用这个办法做，它就有可能出现，胀气爆瓶这么一个有趣的现象）。
　　
　　1、罐体内部的消毒
　　


　　①用高压水枪冲洗附着物（自来水）；
　　
　　②放掉脏水，再次加入自来水（需要覆盖出水口上方），加入适量二氧化氯（产生二氧化氯气体），浸泡、熏蒸10-30分钟，加上盖子；
　　
　　③放掉消毒水，关掉出水阀门，用无菌水由上至下冲洗罐体，使蓄水量覆盖出水口上方后全部放掉，完成整个消毒过程。说白了就是想尽一切办法把罐头变成基本无菌的状态。
　　
　　2、环境消毒和器具消毒
　　


　　①空气消毒的方法：在生产的车间内，安装紫外灯，在加入菌种前开灯照射30分钟（有人的时候尽量不要开紫外灯，因为30分钟太长，对于人来讲会晒伤到皮肤）。或使用高浓度二氧化氯溶液自然熏蒸（这也是很好的一个办法）。将高浓度的二氧化氯溶液放置到鸡舍和猪舍合适的地方，让它自然熏蒸，能有效地杀灭空气中的致病微生物和分解掉一部分臭味。
　　
　　②器具消毒：指的放入罐体内的温度探头、潜水泵、加热管都需要在二氧化氯的消毒液中浸泡2分钟，再用无菌水冲洗（要冲洗干净）后放入罐体。不要把消毒液带入到罐体当中，否则它会杀死掉一部分菌种。

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　　八、干酪乳杆菌简易扩培案例
　　


　　我们再看一下这两张图，这2张照片就是干酪乳杆菌简易扩培案例，左边一张图的颜色相对来说比较黄，表面上有一点点气泡，但是没有什么其他的杂质；右边的那张图表面有明显的一些个体比较大的破不了的气泡，而且表面上有像粉末状的东西，明显的有杂菌。这个东西是什么呢？这些东西实际上是芽孢，灌装之后，容易胀气，并不是因为芽孢在产气而是因为其他的杂菌在产气。
　　
　　所谓的杂菌是什么意思？我们现在指的是做菌种，做的菌种是纯的干酪乳杆菌，提供的纯的干酪乳杆菌菌种。说明书上很明确的写的有90%以上含量是干酪乳杆菌，剩下的不足10%都是属于乳酸菌这一类的，比如讲有植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等，但在菌种这个概念上来讲，那些都叫做杂菌了，因为我们说的菌种是纯的，就是某一种叫菌种。

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　　九、灌装后胀气的常见主要原因：
　　


　　灌装后胀气的常见主要原因：
　　
　　1、        纯的干酪乳杆菌是不产气的，但我们公司现在生产的叫做复合乳杆菌的成品是产气的，因为我们加了很多的其它的乳酸杆菌，我们发现用复合型的乳酸菌用于水产养殖业效果更好一些。
　　
　　2、        胀气的原因有可能是发酵时间过短，培养基还没有消化完，糖类物质还没有消耗完前提下摇动或者运输过程当中不断的振动就可能会产生气体。
　　
　　当然，如果在菌种里面本身就有产气的菌种它当然会产气当然会胀气。现在还有些公司生产的自放气的那种负压的盖子，就是里面有压力了产气了，就自动的把盖子顶开，把气放出去，放到和外面的气压平衡的时候，盖子又关闭起来了。不过我倒是觉得没有必要，因为盖子的成本比较高，采购一个盖子要增加成本，最终还要算到咱们老百姓的头上。

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　　十、养殖户使用自来水或者井水作为水源是否可行？
　　


　　养殖户在简易扩培的时候在没有条件使用无菌水的情况下，使用自来水或者井水作为水源也是可以的，但是会产生部分杂菌。如果现做现用有杂菌也没关系，只是灌装之后是会胀气，如果养殖户马上使用不会有明显的负面影响。
　　
　　但是活菌制剂的生成企业一定要用无菌水作为水源，而且一定要用不锈钢的发酵罐，还有电加热系统等相对来说高端一点的配置来生产。
　　
　　这种简易扩培面向的用户主要是大水面、大规模合作社和一些小型的加工企业（它生产的产品只供应在周边的市场，那是可以的，长途运输就有麻烦了）。
　　
　　不得不说有一些渔民，他的面积不够大，水体不够大，他买回去1吨成品，但他一次只能用半吨，他就先用半吨，然后剩下来的再过3-5天再用。这样行不行呢？当然是可以的，但是一定要注意要，要把它密封，不能感染杂菌，尽可能的让它和空气隔绝，但是这个是很难做到的。

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　　十一、发酵好的乳酸菌能不能长期存放？


　　
　　当存放时间过久产生易臭的时候那就已经可以判定是杂菌污染了，或者在生产过程中你做出来的都不是那种酸香味而是臭味，那肯定是感染了杂菌。在这种情况下依旧是有效果的，虽然有杂菌有臭味，但它用下去还是有效的。
　　
　　说一下存放时间。目前市场上流行的所有的活菌制剂，我们标出的时间大多数比如讲液态的大多数是12个月，但是说句实话，很多的液态制剂如果里面真有活菌的话，6个月之内可能菌数下降的相对缓慢一些，但是6个月以后下降得非常明显、非常的快。

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　　十二、成品菌液的颜色问题


　　
　　一般做出来的菌液的颜色，乳酸菌稀释的产品，它的颜色相对来说是比较淡的，是黄棕色。如果做浓缩的，它的颜色相对来说浓度要高一些，可能是黄褐色，然后还有一些是棕黑色的。
　　
　　这些原因是什么呢？
　　
　　1、        颜色不同，是因为不同批次的培养基的颜色差异对菌液成品的颜色有较大的影响。我们的培养基的颜色通常来讲是近黑色，近黑色也是有区别的，因为我们的培养基也不是完全的一模一样，每一批次培养基可能有一点稍微的颜色差别，但是在营养成分上差别几乎没有，因此培养出来的产品有时候偏淡一些，有时间偏深一些，这都没有关系。
　　
　　2、        颜色的变化还有一个原因就是大量的使用糖蜜做的培养基也会使菌液呈近黑色（这个已经很多企业已经在用了）。糖蜜是糖源，用大量糖蜜，别的什么都不使用，培养出来成品菌液颜色相对来说深一些，但是如果做的成品的颜色就是黑色的那也不科学。我可以负责任地告诉大家，虽然糖蜜的颜色很深，但是经过乳酸菌的代谢之后，它的颜色会变浅，整个菌液的颜色相对来说都会变浅，如果拿到手的，菌液的颜色是黑的或者特别黑，那我就要怀疑它是不是添加了焦糖色素了或者发酵过程不完全。

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　　十三、扩培菌种为什么要用定向培养基
　　


　　乳酸菌的扩培，第一要使用定向的培养基；第二要经常去购买原种而不是自己留种，自己留下来的种可能会变异了，一次变一点一次变一点，从量变到质变到最后真的不是以前的那个功能了，所以你培养出来的东西也许还是保持了原来的酸香味，也许颜色也类似，但是用到水体当中结果将会发生相对明显的变化。
　　
　　我这里还要说明一个观点，如果说大家用糖蜜或者单纯的糖做培养基的话你得到的这个菌数相对来说会低一些。
　　
　　关于菌种的变异了，我这个课件里面也举了两个例子。随着环境的改变、时间的推移，细菌和病毒在不断的变异。营养盐、温度、pH值理化因子都可以成为环境。
　　
　　你比如说禽流感病毒， 2005年的时候是H5N1到了2013年变成了H7N9型，到现在又变异了，但它都是禽流感病毒。
　　
　　再比如造成鱼类细菌性败血症的的元凶嗜水气单胞菌，在国内的不同地区，获得的不同的菌株型就不一样。比如说在湖北找到的嗜水气单胞菌，用它做疫苗发到广东去打；在广东珠三角地区分离到的嗜水气单胞菌，用它做细菌性的疫苗拿到了湖北去打，打到草鱼身上，可能起不到作用。当然我说的是可能，不是一定。因为细菌的菌株型不同，它的毒力也不一样，它的生存能力也不同，包括鱼种也不一样，可能效果就出现了差别。因此致病微生物发生不同情况的变异在不同的地区有不一样的菌株形式很正常。
　　
　　所以在菌种的扩培当中，一味的为了降低成本而留种，留一次，留两次，留三次甚至更多次，其结果并不是我们想象的那么好。

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　　十四、如何做到科学的在水环境中使用乳酸菌制剂
　　


　　乳酸菌制剂说了半天到底是什么，其实大家应该明白了。目前根据农业部微生物产品质量监督检疫检测中心在市场上送样检测到的结果，很多所谓的EM菌实际上就是乳酸菌这一类的扩培的得到的产物。有很多不胀气的产品检测的结果是一个活菌都没有。至于为什么，原因很简单，可能它是产气菌，为了不胀气我们把他杀死掉了，这个有可能。另外还有一些不胀气的新鲜的产品还是有一点活菌，但是具体检测结果我不可能告诉大家，我也负不了这个责任。
　　
　　但是我们可以负责任的讲，目前EM菌这类产品主要起作用还真的就是乳酸菌这一类的物质在起作用。那么，真正的泼洒到水体当中后到底是活菌在起作用还是它的代谢产物在起作用，一句话最终是它的代谢产物在起作用。实际上我们泼洒到水体中的真正的这些微生物制剂，它们都是药引子，我们泼洒的量是很少的，水体是很大的，他们起到的就是一个药引子的作用。
　　
　　当我们把这些有活菌或者没有活菌的微生物制剂倒到水里面之后它第一会激发土著微生物功能上的不断扩张，原本它没有那么多的营养源，现在受到外来的营养源的影响，它会越来越多了，它的功能也就激发出来了，它就更好的起作用了。我们知道微生物是基础的生产者和代谢者，土著微生物的代谢产物又让水体中相对高级一些单细胞浮游植物、多细胞浮游植物、原生动物（包括我们一些小型的轮虫）都可以利用它的代谢产物，这样一来咱们的这个生物圈当中数量就会增加。
　　
　　科学的使用时间，大家记住是在早上的天亮之后尽早使用，而不是等到九点十点或者更晚。原因很简单，它泼到水体里面实际上激发了水体原本存在的各种微生物和浮游植物的生长。你想想看，它起到了这么一个作用，那你是不是应该更早，在有光已经开始天亮的时候就把它投入进去呢？当然有一个前提条件，在缺氧浮头的时候不要用。