光合细菌对鲤鱼非特异性免疫功能的影响

cjlittlepig

摘自《水利渔业》

摘要：实验组光合细菌质量浓度分别为2.5、5.0、10.0 g/m3，在第1、7、14、21、28天检测鲤鱼血液白细胞吞噬活性和血清溶菌酶活性等指标。结果表明，该光合细菌制剂可以提高鲤鱼白细胞的吞噬活性，增强血清溶菌酶活力。鲤鱼的非特异性免疫功能随着光合细菌制剂浓度的增加和泼洒时间的延长呈现增强趋势。

关键词：光合细菌 鲤鱼 吞噬功能；溶菌酶活性

    随着养殖规模的扩大，养殖产量的提高，水产动物疾病频发成为严重威胁水产业的一个突出问题。面对这一问题，水产工作者们开始寻找有效的解决方法。20世纪50年代抗生素广泛地应用于养殖业，70年代人们认识到其在带来巨大效益的同时也带来许多副作用⋯1，因此，人们开始寻找更加有效健康的药物。近年来，维生素、中草药、脂多糖、甲壳质、肽聚糖，微生态制剂等免疫增强剂成为鱼病防治研究的新热点。微生态制剂不仅可净化水质，无药物残留，不产生抗药性，而且可以促进鱼类生长，提高其对环境的耐受力和应激力，产生非特异性免疫调节因子，提高机体免疫力[2]。我们研究光合细菌制剂对鱼类免疫机能的影响，探讨其作用机理，为微生态制剂作为鱼类疾病防治的药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼鲤来自湖北宜昌市养殖基地.体质健壮，无病元伤，质量(80±7.5)g，共200尾。

1.1.2 养殖条件

水泥池4个(3.0 m×3.0 m×0.5m)，每个池子放5O尾鲤，1号池为对照组。水温20～25℃ ，溶氧5～6 mz／L，pH为6.8左右。1周换水1次(换池水的50％)。驯养2周后开始试验。

1.1.3 饲料及投喂饲料购于武汉海大饲料有限公司，为l号鲤鱼配合饲料。每天投喂2次，投饵率3％～5％，以吃饱剩少许为准。

1.1.4 金黄色葡萄球菌制备

    将金黄色葡萄球菌接种于淡水鱼类琼脂培养基斜面上，28℃下培养24-48 h。无菌生理盐水(质量分数0.65％)洗下菌落，并稀释成一定浓度，加入终质量分数为1％的福尔马林，28℃灭活24 h，用无菌生理盐水清洗3次，调整细菌密度至1×108／ml，保存于4℃冰箱中备用。

1.1.5 微生态制荆

    试验所用光合细菌制剂(PSB)系华中农业大学生命科学技术学院实验所培养，主要成分为沼泽红假单胞菌，菌密度为5亿～10亿／g。实验组每7d投放菌液1次，每次剂量为1.0 g／m3，实验进行35 d。

1.1.6 溶壁微球菌购于中科院北京微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 溶壁微球菌的配制

    将溶壁微球菌涂布于营养琼脂上，28℃ 下培养过夜，以制备溶壁微球菌粉末，具体操作见参考文献[3]。

1.2.2 血清及血细胞的收集

    从鲤鱼尾静脉采血，一部分直接加入Eppendorf(1.5ml尖头离心管)中以制备血清，用于溶菌酶测定，另一部分用来(无菌肝素钠)抗凝，供测定白细胞吞噬活性。

1.2.3 吞噬细胞吞噬功能的测定

    参考文献[4]的方法。每次从尾静脉取血1ml，置于含0.5ml肝素溶液(质量分数0.2％)的试管中混匀，加入约0.5 mL的金黄色葡萄球菌液，充分混匀后于25℃ 下水浴60 min。水浴期间每隔10 min摇匀1次。取上述混合液涂片，每个血样涂5片。自然晾干后滴加甲醇固定5～7 min，蒸馏水冲洗，Gien~a染色1～1.5 h，自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗，晾干。油镜观察记录结果。吞噬活性分别以吞噬百分比(Phagocytic Percentixge，PP)和吞噬指数(Phagocyticindex，PI)表示：

    吞噬百分比(PP)=(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数／100)×100％，

    吞噬指数(PI)=(吞噬细胞内的细菌总数／参与吞噬的吞噬细胞数)×100％

1.2.4 溶菌酶活力的测定

    主要依据文献[5,6]的方法进行。用0.067 mol／L PBS(pH 6.4)将溶壁微球菌配成0.2 mg／mL的菌悬液，每个样品取3ml菌悬液，吸取40μL血清加入到3 mL菌悬液中混匀后立刻在540nm下测定A0值。然后在28℃ 水浴中温育30min，取出后置于4℃水浴中以终止反应，再测定A值，按公式计算溶菌酶活力u=( A0一A)／A0。

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2 结果
2.1 光合细菌对鲤鱼吞噬功能的影响
    光合细菌制剂处理组与对照组的鲤鱼白细胞吞噬活性见表1。
    结果显示，光合细菌制剂处理的鲤鱼，吞噬细胞的吞噬活性比对照组要高，且随着时间的增加而增强。t检验表明，3个试验组白细胞的吞噬百分比和吞噬指数均明显高于对照组(P<0.05)。
2.2 光合细菌对鲤鱼血清中溶菌酶活力的影响
    测定结果见表2。
    施用光合细菌制剂后，鲤鱼血清中溶菌酶的活力有明显的提高，10.0 g／m3组的溶菌酶活力变化最大，且随时间的延长而呈增高趋势，第28天达到最高水平。经t检验，施用了光合细菌的3个实验组鲤鱼血清溶菌酶水平都明显高于对照组(P<0.05)。1 g／m3组的效果最好，这与制剂使用说明吻合，明显地提高了鲤鱼血清溶菌酶的活力，从而增强了鲤鱼非特异性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。

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3 讨论
    关于光合细菌对鱼类血清中溶菌酶的影响，目前国内尚未有研究报道，更多的是作为水质净化剂用于水产养殖的研究，且取得了很大的成功，研究结果在日本、东南亚和我国台湾等地得到了普遍的应用[7] 。孙舰军等[8]把光合细菌拌人饲料投喂中国对虾22 d后发现，实验虾的溶菌酶活力比对照组提高53.4％，而我们的实验在第28天后所得结果显示溶菌酶活力提高超过了100％，这可能是研究的对象、药物的施用技术以及环境条件不同所造成的。本试验的结果表明，施药7 d后开始产生作用，并且在第28天效果最高。从结果看，制剂的作用效果随时间延长呈增强趋势，这与简纪常等[2]研究中草药提高建鲤溶菌酶活力的结果有不符之处，关于其持续作用时间还需进一步的研究。
    关于光合细菌对鱼类白细胞吞噬活性的影响，目前尚未发现报道，而其它的免疫增强剂对鱼类白细胞的吞噬活性影响则有相关报道。刘云等[9]用甲壳胺添加于饲料中可提高鲫鱼吞噬细胞的吞噬能力。本试验施用光合细菌制剂后，白细胞的吞噬活性得到了明显的提高，但是施用剂量和施用方法有待进一步研究。作为一种益生菌制剂，光合细菌制剂对水产动物的病害防治前景十分广阔.值得在今后养殖生产中大力推广。在微生态制剂的研究中也存在许多问题[10]，比如优良菌种的筛选，菌剂的保存技术、施用技术和剂量等，都有待深人地研究。

逆游的鱼

哦、原来如此啊